多重PCR-毛细管电泳检测儿童5种腹泻病毒的方法建立及应用*

蔡德丰，陈运生，朱纯青，孟青，肖丽霞，田洁，马东礼

(1. 深圳市儿童医院检验科，深圳 518038；2. 亚能生物技术(深圳)有限公司，深圳 518000)

急性腹泻在全球均有较高的发病率和死亡率，主要发生在儿童和老年人群[1]。目前引起婴幼儿及儿童腹泻的最常见病毒包括轮状病毒(rotaviruses，RV)、诺如病毒(norovirus，NoV)、肠道腺病毒(adenoviruses，Adv)、扎如病毒(sapovirus，SV)及星状病毒(human astroviruses，HAstV)[2-3]。目前约40%的腹泻并不能快速准确诊断出病因[4-5]。病毒的分离培养及鉴定周期较长；免疫学方法在窗口期通常不能反映现症感染；单病原体的PCR方法检测通量较低。本研究首次以儿童常见腹泻病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作为诊断目标，建立多重PCR-毛细管电泳法检测体系，以提高儿童腹泻病毒诊断的效率。

1 材料和方法

1.1临床样本与标准毒株 收集2017—2018年深圳市儿童医院185例儿童感染性腹泻(诊断标准：感染性腹泻诊断标准，WS 271-2007)样本；Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV的标准毒株(参考品)购于厦门至善生物公司。特异性评价的细菌株及毒株肠致病型大肠埃希菌、痢疾志贺菌、副溶血弧菌、肠炎沙门菌及肠道病毒71型来自深圳市儿童医院检验科微生物实验室。

1.2主要试剂和仪器 Hotstart HiTaq一步法RT-PCR Mix(广东菲鹏生物公司)，引物由英潍捷基贸易有限公司(上海)合成，琼脂糖(西班牙索莱宝生物公司)，磁珠法病毒总核酸提取试剂盒(广州美基生物公司)，TGuide S32半自动样本提取仪(北京天根生物公司)；QSEP 100毛细管电泳仪、S1 High resolution凝胶卡匣(中国台湾光鼎公司)。测序送上海生工生物公司。

1.3核酸提取 将10 μL参考品稀释至200 μL；配制108/mL各细菌水溶液，95 ℃ 10 min，12 000 r/min 10 min。取200 μL稀释后参考品、腹泻样本及细菌提取液于TGuide S32半自动样本提取仪上提取核酸，参照磁珠法病毒总核酸提取试剂盒说明书进行。

1.4引物设计、PCR扩增体系及条件建立 从NCBI等数据库检索病毒基因组或某个保守基因的全长序列，筛选出相应病毒的检测靶点：Adv(Hexon)、NoV G1(ORF1-ORF2junction1)、NoV G2(ORF1-ORF2junction2)、RV A(NSP3)、HAstV(ORF1-ORF2之间保守序列)、SV(RdRp-VP1junction)；将参考序列保守性最高的500～600 bp候选区域输入JCVIPrimer Designer生成候选的简并引物，引物序列见表1。扩增体系为25 μL：5×OneStep Reverse Buffer(Mg2+)5 μL，10×Solution I 2.5 μL，dNTP 0.05 μL，dN(U)TP 0.35 μL，Primer Pool 2.5 μL，Enzyme Mix 2 μL，模板 5 μL，ddH2O 7.6 μL。PCR扩增条件方案：(1)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s(每个循环退火温度下降0.7 ℃)，72 ℃ 30 s，20个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 5 min。(2)55 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s(每个循环退火温度下降0.5 ℃)，72 ℃ 30 s，20个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 5 min。(3)常规PCR扩增条件：50 ℃ 15 min，95 ℃10 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 60 s，45个循环；72 ℃ 30 s。并对多重降落PCR、常规PCR扩增进行比较。取扩增产物5 μL，经20 g/L琼脂糖凝胶电泳，电压160 V，时间35 min，用Biorad PowerPac进行验证。

表1 本文所使用引物

注：简并碱基Y代表C/T，R代表A/G，K代表G/T，W代表A/T，M代表A/C。

1.5毛细管电泳检测 取20 μL扩增后核酸样本，使用QSEP 100毛细管电泳仪和S1 High resolution凝胶卡匣对PCR扩增产物进行检测，检测程序为High Voltage Purge 4 V 60 s；Marker Injection 4 V 10 s；Sample Injection 4 V 2 s；Separation Detection 4 V 210 s，计282 s。使用marker为lower marker：20 bp，upper marker：1 000 bp，YN sep Analyzer 软件判读的扩增片段。

1.6体系灵敏度、特异性、重复性及稳定性验证 将标准毒株(3×1011copies/μL)进行10倍梯度稀释，浓度范围3×102～3×310copies/μL，每个浓度进行20次重复试验，将能够检出的最低稀释浓度定义为灵敏度。以Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV为目的扩增毒株，以其他引起腹泻的病原菌(肠致病型大肠埃希菌、痢疾志贺菌、副溶血弧菌、肠炎沙门菌及肠道病毒71型)为非目的病原体制备模板，在优化的多重PCR-毛细管电泳体系下进行分析。通过本体系对检出限进行20次重复检测，计算峰面积，根据峰面积差异计算变异系数(CV)，评价该方法的重复性[6]。将PCR扩增试剂25 ℃加速破坏5 d，反复冻融20次，对浓度为检出限的稀释毒株进行检测，每个病毒重复检测5次，评价其稳定性。

1.7临床样本检测 采用建立方法检测185例临床样本。

1.8测序验证 随机选择5例建立方法检测阳性的RV感染样本，经提取核酸后，对编码RV结构蛋白的VP4及VP7基因设计引物，进行PCR扩增，扩增条件：50 ℃ 15 min，95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，53 ℃ 60 s，40个循环，72 ℃ 30 s。然后对扩增后VP4及VP7基因片段进行双端测序分析，扩增和测序采用同一对引物，见表1。

2 结果

2.1标准毒株PCR产物分析 通过对不同3种扩增条件的比较，最终选择方案(1)(见1.4)的降落条件，可见5种病毒扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果与设计片段长度一致，引物设计合理。见图1。

注：1，Adv；2，HAstV；3，NoV G1；4，NoV G2；5，RV；6，SV；7，5种病毒混合条带；M，marker。

图1PCR扩增片段琼脂糖凝胶电泳分析

2.2毛细管电泳技术建立 5种病毒阳性参考品扩增产物经毛细管电泳后均检测到相应片段，无明显的干扰杂峰出现，其他腹泻病原体核酸对反应体系无影响，见图2。各病毒的检出限及CV分别为：Adv 2.04×103copies/μL，CV=6.96%；HAstV 3.99×103copies/μL，CV=7.24%；SV 8.56×102copies/μL，CV=9.03%；NoV G1 6.94×102copies/μL，CV=7.63%；NoV G2 7.38×103copies/μL，CV=8.12%；RV 2.20×102copies/μL，CV=8.89%。各病毒检出限的CV均小于10%。扩增试剂在25 ℃ 5 d及反复冻融20次后，位于检出限浓度的毒株均能够检出。

注：A，RV(91 bp)；B，SV(112 bp)；C，Adv(126 bp)；D，HAstV(241 bp)；E，NoV G2(352 bp)；F，NoV G1(399 bp)；LM，low marker；UM，up marker。

图25种腹泻病毒阳性参考品毛细管电泳检测结果

2.3临床样本检测结果 185例临床腹泻样本中132例检出阳性，阳性率为71.35%。感染方式分析：单病毒感染101例(54.6%)、双病毒感染31例(16.8%)和无信号阴性样本53例(28.6%)。其中，Adv 22例(11.9%)、HAstV 10例(5.4%)、NoV G1 0例(0%)、NoV G2 11例(5.9%)、RV A 105例(56.8%)和SV 15例(8.1%)。结果见图3。

注：A—E，分别为 Adv和RV(91 bp，125 bp)混合感染、RV和NoV G2(91 bp，356 bp)混合感染、SV(113 bp)感染、RV A(92 bp)感染、Adv(120 bp)感染、HAstV(240 bp)感染；LM，low marker；UM，up marker。

图3部分临床样本核酸毛细管电泳检测结果

2.4测序结果分析 将编码RV结构蛋白的VP4及VP7基因的测序结果与GeneBank比对分析，结果序列一致。VP4及VP7部分测序序列见图4。

图4 RV病毒VP4(A)及VP7(B)部分基因片段测序结果

3 讨论

本研究选取病毒保守序列进行PCR分析，在设计引物同时注意病毒间产物长度的差异化，以便于毛细管电泳的直观判断分析。首先对PCR反应体系进行优化，摸索出基于降落PCR技术的最终扩增反应条件，以保证扩增效率及扩增稳定性。通过琼脂糖凝胶电泳验证，无非特异性扩增条带；阳性参考品经毛细管电泳检测条带长度与设计长度基本一致，未出现明显非特异性检测峰；虽YN sep Analyzer软件判读后，与实际片段存在一定差异，这与实验条件中存在误差有一定关系，并不影响结果判断。本研究建立的方法与大肠埃希菌﹑痢疾志贺菌﹑副溶血弧菌﹑肠炎沙门菌及肠道病毒71型腹泻病原体无交叉反应，特异性强；Adv、NoV G1、RV A、SV及HAstV检出限均小于5×103copies/μL，NoV G1小于1×104copies/μL，具有较好的敏感性；在重复性方面，CV均小于10%；扩增试剂在25 ℃ 5 d及反复冻融20次，位于检出限浓度的毒株均能够检出，稳定性较好；通过对轮状病毒结构基因VP4及VP7进行测序分析，与GeneBank的标准序列一致，具有较高的准确性，能够满足临床实验室诊断的需求。本检测方法检测通量高，适合批量检测；且分析系统能够对毛细管电泳的电泳图谱及检测峰自动分析，结合marker分析片段的长度，根据片段长度判断腹泻病毒的种类；该检测体系从样本处理到分析出结果近3 h，相比其他检测手段具有高通量、低成本、临床操作性强及检测效率高的特点，但实验室需配备凝胶电泳仪及培训后的专业检测人员。

185例临床腹泻样本经本体系检出132例病毒感染，阳性率达71.35%，5种腹泻病毒均检出；单病毒感染及复合病毒感染分别为101例及31例，以单病毒感染为主；腹泻病毒检出情况包括RV A感染105例、Adv 22例、SV 15例、NoV G2 11例和HAstV 10例，主要集中在轮状病毒和腺病毒，与Thongprachum等研究结果基本一致[2]。