基于纳升电喷雾-轨道阱超高分辨质谱对完整单克隆抗体药物进行分子量测定及糖型鉴定的条件探究

代荣荣，马 鑫，邵心阳，柴胡玲潇，王冠博*

(1.南京师范大学 化学与材料科学学院，江苏 南京 210023；2.北京诺和诺德医药科技有限公司，北京 102206；3.北京大学 前沿交叉学科研究院，北京 100871；4.深圳湾实验室 细胞分析研究所，广东 深圳 518055)

单克隆抗体(mAb)药物由于其结合特异性、靶点多样性、设计定向性等特点，近年来在研发投入、审批数量和市场规模等方面发展迅速[1]。mAb作为一类蛋白质，不仅具有分子量大、结构层次复杂的特点，还在翻译后修饰(PTMs)等因素的作用下，呈现一定程度的固有结构微异质性[2-5]。在多种PTM中，糖基化不仅是微异质性的重要贡献者，更对mAbs的构象、半衰期、功效和安全性等方面产生重要影响[6-8]。对mAb进行分子量测定并鉴定共存的糖型，对mAb的设计、生产和临床使用均至关重要。

质谱(MS)技术当前已被广泛用于mAb的分子量及糖型分析。在酶解所得的游离糖基链层面、糖肽层面和完整mAb层面进行糖型分析各具优缺点[9-13]，其中在完整mAb层面进行糖型分布剖绘引入的样品前处理最少，操作最为便捷，理论上具有更高的测定通量。此外，由于无需对碎片信息进行拼合，该方式获得的分子量信息更加直接，所得糖型分布更能反映药物分子层面的实际情况，在无需分析糖基链结构的情况下，堪为首选策略。既有研究表明，利用纳升电喷雾(Nanospray)离子化方式和超高分辨质谱仪器，在低流速下测定完整mAb可获得较理想的分子量和糖型数据[14-15]。然而，由于对完整糖蛋白的测定涉及高分辨仪器及相对复杂的参数设置，分子量及糖型测定结果可因多种仪器设置、操作参数及溶液条件的影响而产生假阳性或假阴性结果。为保证测定结果的准确性，需对相关条件的影响进行深入研究，并在测定中对实验条件进行细致优化。

本文以经过完善质量控制的mAb为标准样品，以具有完整大型蛋白分子测定能力的超高分辨质谱为工具，考察了低流速进样模式下，仪器分辨率、源内裂解、碰撞诱导碎裂、溶液组成等条件对分子量及糖型测定结果的影响，以期获得优化的完整mAb分子测定方案，助力于mAb的表征和相关研究。

1 实验部分

1.1 材料试剂

单克隆抗体(mAb)样品由北京诺和诺德医药科技有限公司提供；乙酸铵(NH4Ac)、甲酸、甲醇均为色谱纯，购自美国Thermo Fisher Scientific。

1.2 仪器设备

Q Exactive UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪，配商品化静态纳升电喷雾离子源(德国Thermo Fisher Scientific)；NanoDrop 2000紫外可见吸光光度仪(美国Thermo Fisher Scientific)。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理取适量mAb原液置于分子量截断值为50 kDa的超滤管(美国Milipore)中，在4 ℃下离心超滤，补入150 mmol/L NH4Ac溶液进行盐溶液置换，得样品浓溶液。非变性样品、变性样品分别以150 mmol/L NH4Ac水溶液、含体积分数75%甲醇及0.5%甲酸的水溶液稀释至2 μmol/L。溶液浓度测定利用波长为280 nm的紫外光吸收实现。

1.3.2 质谱分析取2～2.5 μL样品溶液注入静态喷针(德国Thermo Fisher Scientific)进行纳升电喷雾离子化进样。除正文提及的变量参数外，主要参数如下：microscan：5，maximum injection time：100 ms，desolvation voltage：-10 V。如无特殊说明，折合m/z400处的分辨率均设为50 000。二级质谱(MS2)分析中母离子选择宽度为100 Th。数据图中每个质谱图均为80帧原始谱图积累所得。数据采集过程中保持喷雾电压和喷针位置不变，避免其对分析物价态分布的影响。

1.3.3 数据处理去卷积化分析利用BioPharma Finder 3.1(Thermo Fisher公司)软件进行，采用isotopic profile模式输出分子量分布；糖型鉴定采用既往工作[16]中所述方法。

2 结果与讨论

2.1 源内碎裂的影响

源内碎裂(In-source fragmentation)可通过样品离子与空气分子的碰撞改善去溶剂化性能，减少加合物，提高分子量测定的准确度。如源内碎裂不充分，可能产生较多加合物信号及非特异性寡聚体信号[17]；而源内碎裂过强，则可能导致样品分子自身发生共价键断裂。在对mAb的测定中，关闭源内碎裂所得谱图中除mAb单体外，可见少量非特异性结合的二聚体及三聚体存在；开启源内碎裂，则随着能量加强，非特异性寡聚体丰度减少甚至消失(图1A)，mAb单体的平均价态略有升高，各价态对应的m/z分布呈现如图1B所示的变化：未开启源内碎裂时m/z分布较宽，可见较多未完全分离的信号峰；随着碎裂电压升至150 V，m/z分布趋于简化，3个主要信号峰中相邻2个所对应的分子量差异均为162 Da，为六碳糖残基对应的分子量。依据mAb糖基链的结构特点，此图说明相应3个糖型中相邻2个相差1个半乳糖残基。依据信号的相对强度关系，可定量解析相应糖型的相对丰度关系。在此3个信号峰右侧相差35～38 Da处可见加合物信号峰，且随碎裂能量增大而逐渐减弱；开启源内碎裂且碎裂电压升至150 V前，低丰度信号峰图无明显变化，表明在此条件区间内鉴定低丰度糖型较为可靠。碎裂电压升至200 V后，主要信号峰有明显展宽，对应的平均分子量均减小，表明发生了较大程度的中性丢失，分子量测定值已不可靠；在低m/z区可见大量碎片离子峰，同样表明在极端的源内碎裂条件下mAb自身发生碎裂。

2.2 仪器分辨能力的影响

仪器分辨能力及分辨率设定值直接影响谱图的分辨率以及分子量接近的糖型是否能被明确区分。可利用可能存在的残基间的分子量数值，通过计算获得区分不同糖型所需的最低分辨率。如表1所示，己糖及脱氧己糖分子量之差为16 Da；若2个mAb分子之间1条糖基链等同而另1条糖基链分别为G2及G1F，则在完整mAb层面至少需要约9 400的谱图分辨率方能区分两种分子。由于仪器操作界面中可调节的分辨率数值仅为针对低m/z的等效参考值，因此需根据仪器在高m/z区域的实际分辨性能调节分辨率设定值。

表1 几种代表性单糖残基的分子量差异

*relative to theMWof an intact mAb(approximately 150 kDa)

图2 +22价mAb离子在不同标称分辨率(m/z 400等效)下的非变性质谱信号分辨情况

针对此mAb样品，考察了m/z400处等效标称分辨率设定值为3 125～50 000范围的信号分辨情况(源内碎裂电压调至150 V，图2)。结果显示，仅当标称分辨率达到50 000时，主要糖型峰及其邻近的加合物峰(分子量差值测定值为35～38 Da)可被分辨；标称分辨率为12 500时，大量低丰度糖型难以检测；标称分辨率降至3 125时，高丰度糖型也无法区分，谱图中仅能通过峰值处对应的m/z计算最高丰度糖型对应的平均分子量。

图3 +23价mAb离子在不同碰撞能量下的m/z图(HCD模式)

图4 变性条件对完整mAb谱图的影响

2.3 碰撞诱导碎裂的影响

在质谱质量分析器内部发生的碰撞诱导碎裂(CID)可起到进一步去除加合物的作用，但因其多为多级质谱分析所采用，碰撞能量可调上限较高，在可调节区间内更容易造成分析物自身的碎裂。由于唾液酸等单糖残基容易在碰撞中丢失，碰撞也会造成糖型鉴定失真。本实验所用仪器通过高能碰撞解离(HCD)实现碰撞。如图3所示，当使用N2作为碰撞气时，5%的碰撞能量有效消除了加合物而未引起其它明显变化，虚线框中所示的低丰度糖型信号未受影响；10%的碰撞能量造成了明显的中性丢失，使主要糖型信号峰对应的平均分子量减少70 Da左右，同时由于基线升高，使得低丰度糖型信号被掩盖。如使用Xe作为碰撞气，5%左右的碰撞即造成了更大程度的中性丢失，使得最高丰度分子量减小300 Da以上。

2.4 溶液条件的影响

对完整mAb的测定在多种情况下需使用含有机溶剂或酸的变性条件，如与液相分离手段的在线/离线联用[18]、对mAb的稳定性研究[19]等。尽管在常规ESI等高流速条件下有机溶剂或酸的存在可一定程度上提高信号响应，但由于二者可显著改变溶液黏度等流体性质，在低流速下进样时，需对最适条件进行更加细致的优化。本研究使用含体积分数75%甲醇和0.5%甲酸的水溶液配制变性条件样品溶液，采用源内碎裂150 V、标称分辨率50 000、HCD模式关闭的条件采集数据，结果如图4所示。此条件下mAb的价态呈现二重分布，高价态分布中丰度最高的价态为+36，表明mAb发生了显著的去折叠；低丰度分布的平均价态及分布宽度较非变性谱图也明显增加(图4A)。分别取低、高价态分布中的单一价态图样(图4B及图4C)观察，仍可见主要糖型的信号峰，但由于基线显著升高且出现了大量加合物信号峰，主要糖型的信号分辨率及相对强度都受到很大影响。

图5 多种条件下完整mAb质谱数据的去卷积化结果比较

2.5 去卷积化结果所受的影响

将上述条件下所得的质谱数据进行去卷积化处理，可得完整蛋白分子量分布图(图5)。在非变性条件(Native condition)的测定中，理想条件下(Optimal)，主要糖型对应的峰(图5中竖直实线所示)得到明显分离，可利用各自的峰面积进行糖型分布的相对定量，低丰度糖型对应的峰清晰且可分辨；在低源内碎裂等情况下的去溶剂化不良条件下(Suboptimal desolvation)，可见主要糖型对应的峰，但由于大量其它相邻信号峰的存在，分辨率及定量准确度都会受到很大影响。这些其它信号峰中既包含溶剂及盐离子参与形成的加合物峰[20]，也可能包含真实存在且在气相中易碎的糖型所对应的信号峰。图5中点划线及等距虚线所示的3组信号峰均与左侧相邻的主要糖型信号峰对应分子量相差较为固定的数值((61±1)Da及(127±4) Da)，可能由含有唾液酸等易掉落残基的糖型所产生。即使这些信号峰确由相关糖型引起，对其进行保留的意义依然有限，原因包括：(1) 相关糖型对气相碰撞条件极为敏感，碎裂程度难以精确控制；(2) 相应信号易与加合物信号及其它稳定糖型信号重叠，影响谱图分辨效果，进而影响糖型鉴定和定量；(3) 唾液酸残基与己糖残基的分子量差值(129 Da)与C-端赖氨酸剪切(在mAb骨架上经常发生)所造成的分子量差值(128 Da)相近，极易造成对蛋白型的错误归属。因此，适当增强碎裂效果，使唾液酸残基掉落，保持剩余糖型在较宽条件范围内分布稳定，可能为糖型鉴定带来更大收益。如需测定含唾液酸糖型的含量，可由衍生化等方式进行处理，提高相应糖型的稳定性后实现[21]。在源内碎裂程度极高或发生程度较高的CID等情况下，mAb分子因发生自身碎裂并丢失电中性碎片(Neutral loss)，质谱图发生扭曲，且低丰度糖型信号被掩盖，同样会增加大量的假阳性糖型鉴定结果。在非变性条件下(Denaturing condition)，若无法在数据采集阶段达到最佳的去溶剂化效果，无论通过高价态分布还是低价态分布信号进行去卷积，所得结果均为基线较高、结合物种类较多且丰度较高、分辨率较低的质量分布，难以进行准确的糖型鉴定。这也表明在通过液相色谱-质谱联用或毛细管电泳-质谱联用等方式测定完整mAb分子量时，需在参数优化上付出更多的努力，以减小去溶剂化不良带来的影响。

3 结 论

使用质谱手段对完整mAb药物分子量测定和糖型鉴定时，在低流速下进样(如使用纳升电喷雾离子化)可节约样品并获得较高的离子化效率。非变性质谱测定可在较宽的条件范围内获得稳定的分析结果；而在常规电喷雾离子化进样中对信号响应有提升作用的变性条件(含有机溶剂或酸)反而易对数据质量产生不利影响，需针对去溶剂化性能进行细致的条件优化以减少加合物的干扰。在变性条件下测定时，为确保分子量及糖型分析结果的准确性，理想情况下需与非变性条件下所得结果或其它分析方法所得结果相比较，进行方法验证；在非变性条件下，源内碎裂程度、仪器分辨率、CID、溶剂条件等均会对测定结果产生显著影响，需根据这些参数的影响程度、条件控制难易及相应的结果收益进行综合评价，选择合适的参数。根据本项工作的实验结果，为保证测定数据稳定可靠，建议使用中等强度的源内碎裂参数，提升去溶剂化效果，减少溶剂/盐加合物的形成，并避免发生mAb分子的共价键断裂；建议使用具有高分辨能力的质谱仪器，并调节设置使实际信号的谱图分辨率达到4 000以上(实际分辨率受去溶剂化等条件的影响，难以通过低m/z区的标称分辨率进行直接换算)，以确保分子量相近的糖型得以分辨；若仪器具有CID功能，建议不开启CID或仅在需要增强去溶剂化效果的情况下启用最低能量的CID，避免mAb的碎裂。

致谢：本工作受到国家自然科学基金青年项目(21605085)及中国科协青年人才托举工程项目(2017QNRC001)的资助。感谢北京诺和诺德医药科技有限公司提供样品和抗体技术支持；感谢与该单位杨志茹博士及吴晓爱博士进行的有益讨论。