胰岛素样生长因子-1对高胆红素血症新生大鼠脑组织Bcl-2和Bax表达的影响

苏 晴，阴怀清2，刘文俊，王 婷

新生儿由于其胆红素代谢的生理特点，加之各种病理因素的综合作用，未结合胆红素增多的高胆红素血症在临床上很常见[1]，严重者可能遗留胆红素脑损害，发生失聪、躯体运动功能障碍、智能障碍等严重后果，同时加重了家庭、社会的负担[2]。近年来，研究表明，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)是神经元结构、功能和可塑性调节中的重要因子，在整个生命周期中对维持适当的脑功能起着关键作用[3]。本实验的目的是建立高胆红素血症模型，观察IGF-1干预后脑细胞凋亡和Bcl-2和Bax表达的动态变化，探讨IGF-1脑保护的可能机制，为高胆红素血症的临床防治提供新思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 7 d龄新生SD清洁级大鼠120只(由山西医科大学动物实验基地提供)，体重12～17 g，雌雄不限，随机分成对照组(A组)、高胆红素血症模型组(B组)和IGF-1干预组(C组)，每组40只，各组再根据人工处死大鼠时间(6 h、12 h、24 h、48 h和72 h)分为5个亚组，每个亚组8只。

1.2 胆红素液体制备[4]在遮光的环境下，精确称量胆红素晶体(购自美国Sigma公司)50 mg，溶于1 mL 0.5 mol/L氢氧化钠溶液中，加入9 mL双蒸水，用0.5 mol/L盐酸将pH值调至8.5，浓度为85.5 μmol/L，并于1 h内使用。

1.3 造模及干预方法 造模：B组和C组腹腔内注射新鲜配制的胆红素液100 μg/g，建立高胆红素血症模型，A组腹腔内注入等体积的胆红素溶剂。干预方法：C组于造模后立即腹腔内注入IGF-1(购自武汉博士德生物技术公司)200 μg/g，A组、B组腹腔内注入等体积的生理盐水。给药后各组动物返回原饲养环境由母鼠母乳喂养至相应时间点[4]。

1.4 观察指标

1.4.1 行为学观察 每组动物在处理后，肉眼观察不同时刻大鼠的异常行为变化(如尖叫、抽搦、翻腾、俯卧及刺激后是否发生躲避等)。

1.4.2 病理学观察 新生大鼠在模型建立后的不同时间点左心室灌注后(注意留取左心室血液，离心后取上清液，测定血浆中胆红素浓度，确认高胆红素血症模型制备成功)，断头取脑，小心解剖获得完整脑组织，并置于甲醛溶液中保存，常温条件下，行固定、石蜡包埋(视交叉及其后5 mm，包含海马区)、冠状位切片及HE染色，在显微镜下检测模型是否制备成功及大脑海马部位细胞形态结构，选择与苏木素-伊红(HE)相邻切片做免疫组化及TUNEL检测(由武汉博士德生物技术公司提供)。免疫组化法：兔Bax和Bcl-2单抗体(一抗)，SABC免疫组化试剂(二抗)，严格按照说明书步骤检测Bax和Bcl-2表达；TUNEL检测法：严格遵守TUNEL试剂盒说明，观察凋亡的阳性表达及计算凋亡率或凋亡指数(凋亡细胞个数/全部细胞个数×100%)。

1.4.3 图像处理 应用美国Aperio公司Scanscope数字病理扫描系统，对每张脑组织病理切片任意选取4个视野进行扫描、取图和分析。由计算机检测大脑海马部位细胞Bcl-2和Bax表达的灰度值，取其均数，并计算其OD值(OD值=logA/B，其中A=240，B为灰度值)。

2 结 果

2.1 神经行为改变 A组新生大鼠无异常神经行为变化，B组造模后8 h左右出现明显异常行为表现，如尖叫、抽搦、翻腾、俯卧及刺激后躲避迟缓等，C组约12 h出现上述变化，但异常表现不如B组明显。

2.2 HE染色 A组大脑海马部位细胞形态正常，排列规则，细胞核清晰可见，无细胞缺失；B组、C组均见大脑海马部位细胞变少、变形，结构混乱，细胞核缩小、溶解、破碎，符合凋亡的形态改变，但与C组同一时刻比较，B组的变化更为明显。详见图1。

图1 各组大鼠海马区脑组织病理图(HE×400)

2.3 Bax表达变化 阳性表达Bax的细胞胞质或胞核被棕黄色染色，A组Bax阳性表达较少，B组Bax表达于6 h开始逐渐增多，48 h继续增高，72 h表达处于高峰；C组Bax表达明显较同时间B组减少，但仍高于同时间A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表1、图2。

组别6 h 12 h 24 h 48 h72 hA组161.743±0.698161.901±0.847 161.662±0.977161.862±0.784161.141±0.729B组154.884±0.313①154.205±0.623① 153.905±0.562①153.585±0.437①153.485±0.437①C组 159.562±0.414①② 158.674±0.397①② 158.570±0.392①② 157.605±0.484①② 157.306±0.310①②F值243.433 177.284 160.444 246.926269.421P <0.05<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05。

图2 各组大鼠脑组织不同时间Bax表达情况(DAB×400)

2.4 Bcl-2表达变化 细胞中有Bcl-2阳性表达时，其胞质或胞膜呈棕黄色染色，A组Bcl-2阳性表达极少；B组Bcl-2表达于6 h开始加强，后逐渐加强，48 h达到峰值，72 h处于恒定高值； C组Bcl-2表达明显较同时间A组、B组增多，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2、图3。

组别6 h12 h24 h48 h 72 hA组 161.763±0.688 161.902±0.772 161.862±0.771 161.662±0.507 161.482±0.537B组 159.642±0.335① 158.674±0.397①158.630±0.363① 158.005±0.535① 157.626±0.636①C组 154.884±0.313①② 154.310±0.406①② 154.105±0.481①② 153.785±0.465①② 153.625±0.402①②F值265.401 236.905 237.844 306.603 270.852P <0.05<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05。

图3 各组大鼠脑组织不同时间Bcl-2表达情况(DAB×400)

2.5 大脑海马区神经细胞凋亡 A组大脑海马区极少细胞凋亡，B组6 h后可见大脑海马区神经细胞凋亡，12～24 h增加，48 h明显增加，72 h达到峰值，C组各时间大脑海马区神经细胞凋亡较B组少，但仍高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3、图4。

组别 6 h12 h24 h48 h 72 hA组 1.067±0.711 1.075±0.7211.087±0.725 1.087±0.724 1.089±0.729B组 6.505±0.589① 9.951±0.615① 11.361±0.425① 12.943±0.603①14.723±0.371①C组 3.794±0.787①② 6.441±0.589①② 9.216±0.694①② 9.765±0.468①② 12.578±1.489①②F值60.268192.497296.842407.884223.907P <0.05 <0.05<0.05 <0.05<0.05

与A组比较，①P<0.05；与B组比较，②P<0.05。

图4 各组大鼠脑组织海马区不同时间点神经细胞凋亡情况

3 讨 论

高胆红素血症动物模型有多种制备方法，本实验选择最常用的腹腔注射胆红素的方法制备模型，操作简易，成功率高[4]。7 d龄新生大鼠脑组织和新生儿脑组织的发育在组织学方面相似[5]，发育不完善的血-脑屏障是血中游离胆红素增高易致胆红素脑损害的重要因素[6]，因此，本研究选择7 d龄新生SD大鼠制备高胆红素血症疾病模型。

高胆红素血症脑损害的具体机制错综复杂，但研究证明胆红素对脑的损伤是有选择性的，并且海马区、下丘及大脑皮质对胆红素表现出了特殊的敏感性，胆红素神经细胞毒性的发挥可能是在质膜扰动、兴奋毒性、神经炎症、氧化应激和细胞周期阻滞等多因素的联合作用下，最终导致了细胞凋亡[7]。在分离的脑细胞培养中可以观察到，在游离胆红素作用下，神经元树突受到损害同时小胶质细胞和星形胶质细胞被诱导释放促炎性细胞因子[8]。

凋亡是复杂基因控制下维持存活/死亡平衡的编程性细胞死亡[9]，在维持机体内环境的稳定中有重要意义，发现凋亡的具体机制对于探索疾病防治方法有重要价值。通过查阅文献发现，Bcl-2家系在凋亡的信号调节中发挥着关键作用，包括对抗凋亡基因(Bcl-2为代表)和促进凋亡基因(Bax为代表)，对抗凋亡的基因与促进凋亡的基因的相对数量(尤其是Bcl-2/Bax比率)组成了凋亡的分子开关，其结构多样，功能复杂，至今仍未完全揭秘[10-11]。在本实验中，人工制作高胆红素血症动物模型，观察随时间推移Bcl-2和Bax表达的变化，揭示胆红素的神经损害作用，在模型组中可以看到：Bcl-2表达早期开始增加，48 h增加至高峰，72 h处于平稳；与此同时，Bax的表达是增加的，于72 h达高峰，Bcl-2/Bax比率降低，TUNEL法测定的凋亡指数逐渐增加，于72 h达高峰，这进一步证实了Bcl-2对抗凋亡及Bax促进凋亡的作用。

IGF-1是一种多肽类营养神经的物质，与胰岛素的分子结构相似，可调节细胞的生长和分化，维护脑组织的正常功能[12]。IGF-1还可抑制凋亡，有助于受损组织功能的复原。刘芳等[13]研究发现，新生儿发生高胆红素血症时血清IGF-1浓度下降，且降低程度和血清胆红素水平成反比；尹路等[14]研究显示，36名第1天出生的早产儿IGF-1水平与所需光疗时间成反比，表明IGF-1水平与机体对胆红素的处理能力相关。在本实验中，在动物模型中应用IGF-1干预后，与模型组相比，各时间细胞凋亡减少， Bcl-2表达增加，Bax表达降低，这说明IGF-1可能通过增高Bcl-2的表达，降低Bax的表达发挥抑制细胞凋亡的作用，但是具体的机制还有待进一步研究。

综上所述，本实验观察到高胆红素血症新生大鼠大脑中，随时间推移Bcl-2、Bax表达和凋亡的关系，而神经细胞营养因子IGF-1，可能通过增高Bcl-2的表达、降低Bax的表达而抑制受损脑组织的凋亡，发挥脑保护作用。这为IGF-1在临床中防治新生儿高胆红素血症应用的可能性提供了新的思路，但尚需国内外大量研究和临床试验的支持。