前列腺素E2诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中p38MAPK信号通路蛋白的表达

才忠民，王 欢，尚 平，王 琦，李劼若

1)广州市花都区人民医院脊柱外科 广州 510800 2)暨南大学附属第一医院运动医学中心 广州 510630

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种可定向分化为神经细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的多能干细胞，因具有取材方便、增殖能力强和免疫排斥反应弱等特点，成为骨折愈合和骨再生等骨组织工程的理想种子细胞[1]，而如何使BMSCs快速向成骨细胞定向分化一直是骨损伤修复研究的热点。前列腺素E2是一种由机体产生且分布广泛的非肽类小分子物质，除作为炎性介质外，在促进骨形成方面也发挥着重要作用[2-4]。丝裂原活化蛋白激酶是一类参与细胞分化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)是该家族中与成骨分化关系密切的重要成员[5-6]。已有研究[7]发现，前列腺素E2可诱导BMSCs成骨分化，并推测p38MAPK信号通路可能在其中发挥重要作用。本研究以前列腺素E2和p38MAPK阻断剂SB203580处理大鼠BMSCs，检测细胞中碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase，ALP)、Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)mRNA的表达，探讨p38MAPK信号通路是否参与了前列腺素E2诱导的BMSCs成骨分化。

1 材料与方法

1.1主要试剂与仪器前列腺素E2高纯度粉末购于美国Sigma公司，L-DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购于美国Gibco公司，SB203580和Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，Triton X-100购于北京索莱宝公司，p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、β-actin抗体购于美国Cell Signaling Technology公司，反转录试剂盒购于美国Thermo Fisher公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，RIPA蛋白裂解液、ALP检测试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所，CO2培养箱和酶标仪为美国Thermo公司产品，倒置显微镜为日本Olympus公司产品，凝胶成像仪为美国Bio-Rad公司产品，紫外分光光度计为美国MJ公司产品。

1.2BMSCs的分离、培养及分组4～6周龄SD雄性大鼠，体重80～120 g，购自山西医科大学动物实验中心。 将SD大鼠脱颈处死后，经体积分数75%乙醇消毒，于无菌条件下取股骨和胫骨。以L-DMEM培养基冲洗骨髓腔，收集冲洗液，得到骨髓细胞悬液，采用含体积分数15%胎牛血清的L-DMEM培养基于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱内培养，每2 d换液一次。待细胞铺满瓶底90%时，加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，以1∶2比例传代，收集第3代细胞进行实验。实验分为3组。空白组细胞用完全培养基培养；前列腺素E2组细胞用含1×10-5g/L前列腺素E2的培养液培养；前列腺素E2+SB203580组细胞首先用SB203580处理30 min，然后加入1×10-5g/L前列腺素E2的培养液培养。分组培养14 d后进行指标检测。

1.3细胞中p-p38MAPK、p38MAPK的检测分别收集3组细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，离心收集上清，采用BCA法测定总蛋白的浓度及纯度后，加入上样缓冲液煮沸5 min。取变性后的总蛋白50 μg进行SDS-PAGE。蛋白分离后电转于PVDF膜上，浸入用TBST配制的50 g/L脱脂奶粉封闭液中处理1 h。加入p-p38MAPK、p38MAPK及β-actin抗体(稀释度均为1∶1 000)于4 ℃反应24 h，封闭液洗膜15 min×3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶2 000)于37 ℃反应1 h。暗室曝光，采用凝胶成像扫描系统分析条带灰度值，以目的条带与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.4细胞中ALP活性检测分别收集3组BMSCs，以磷酸盐缓冲液冲洗2次，加入0.1%Triton X-100 500 μL于4 ℃反应过夜。离心收集上清液，BCA法检测蛋白浓度，按照ALP检测试剂盒说明书操作，检测ALP活性，检测波长520 nm，将结果换算为金氏单位。实验重复3次。

1.5细胞中ALP、Runx2、OPN、BMP-2和Cbfα1mRNA的qRT-PCR法检测分别收集3组BMSCs，采用Trizol法提取总RNA，并以紫外分光光度计测定其纯度、浓度。参照反转录试剂盒说明，以RNA为模板合成cDNA，然后行PCR。引物序列见表1。PCR反应体系：10 μL的 2×SYBR Green qPCR Mix，正、反向引物各0.5 μL， cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。扩增条件：预变性95 ℃ 5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，循环40次。采用 2-ΔΔCt法计算目的mRNA的表达水平。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 22.0进行统计学分析。3组p-p38MAPK/p38MAPK比值、ALP活性，各目的mRNA表达水平的比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

表1 引物序列

2 结果

2.13组细胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值的比较见图1和表2。与空白组相比，前列腺素E2组细胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580组较前列腺素E2组降低(P<0.05)，但仍高于空白组(P<0.05)。

1：空白组；2：前列腺素E2组；3：前列腺素E2+SB203580组

2.23组细胞中ALP活性的比较ALP活性测定结果见表2。前列腺素E2组ALP活性高于空白组(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580组中ALP活性较前列腺素E2组降低(P<0.05)，与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 3组细胞中p-p38MAPK/p38MAPK比值及ALP活性的比较

2.33组细胞中成骨分化相关基因ALP、Runx2和OPN mRNA表达的比较见表3。与空白组相比，前列腺素E2组细胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表达水平均升高(P<0.05)；而前列腺素E2+SB203580组3个指标较前列腺素E2组降低(P<0.05)，其中Runx2和OPN mRNA表达水平仍高于空白组(P<0.05)。

表3 3组细胞中ALP、Runx2和OPN mRNA表达水平的比较

2.43组细胞中骨向分化调控因子BMP-2和Cbfα1mRNA表达的比较见表4。前列腺素E2组细胞中BMP-2 和Cbfα1 mRNA表达水平高于空白组。前列腺素E2+SB203580组细胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表达水平较前列腺素E2下降(P<0.05)，其中Cbfα1 mRNA表达水平低于空白组(P<0.05)。

表4 3组细胞中BMP-2和Cbfα1 mRNA表达水平的比较

3 讨论

前列腺素E2在多种干细胞的增殖和分化过程中发挥了重要作用。前列腺素E2可通过PI3K/Akt信号通路诱导BMP-2生成，进而诱导肌腱干细胞向成骨细胞分化[8]；可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进神经干细胞的增殖，并诱导其向神经元方向分化[9]；还可通过活化受体EP4增加造血干细胞的数量，调节造血系统的稳定性[10]。此外，前列腺素E2还在调控骨组织形成、骨代谢、成骨细胞增殖、胶原合成和免疫调节等过程中扮演重要角色，在BMSCs的增殖和成骨分化过程中发挥重要的促进作用[7,11-12]。但目前关于前列腺素E2诱导BMSCs成骨分化的机制并不明确。p38MAPK信号通路是细胞内重要的信号通路，其可通过三级级联反应被磷酸化激活，参与细胞的生长、发育和分化等生理病理过程。已有报道[13-15]证实，p38MAPK信号通路在高糖诱导成骨细胞凋亡、成骨前MC3T3-E1细胞的分化以及BMSCs成骨分化过程中发挥重要作用。

ALP是成骨早期标志物，Runx2是在骨形成早期阶段监管成骨分化和骨形成的重要转录因子，OPN是中后期成骨分化的重要标志物[16]。与p38MAPK信号通路关系密切的重要的骨转化调控因子有BMP-2和Cbfα1；前者是骨生长的启动因子，可通过激活p38MAPK信号通路诱导BMSCs向成骨细胞分化[17]；后者是骨向分化特异性转录基因，可诱导多潜能间充质干细胞向成骨细胞表型分化，激活OPN和OC等成骨基因的转录，抑制p38MAPK信号通路可引起Cbfα1表达下调[15,18]；两者均是BMSCs向成骨细胞分化的重要调控因子。已有研究[18]指出，前列腺素E2可通过结合EP4受体增加间充质干细胞中BMP-2的表达。

我们在Liu等[7]研究的基础上，选用浓度为1×10-5g/L的前列腺素E2与大鼠BMSCs体外共培养，Western blot法检测发现共培养后BMSCs中p-p38MAPK/p38MAPK比值升高，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表达升高，骨转化调控因子BMP-2和Cbfα1 mRNA的表达也升高；利用p38MAPK阻断剂SB203580阻断BMSCs中p38MAPK的活化后，前列腺素E2诱导的BMSCs中p38MAPK磷酸化水平下降，ALP活性以及ALP、Runx2、OPN mRNA的表达均降低，BMP-2和Cbfα1 mRNA的表达也降低；提示p38MAPK信号通路在列腺素E2诱导BMSCs成骨分化过程中发挥了促进作用，前列腺素E2可能通过激活p38MAPK信号通路进而调控BMP-2和Cbfα1的表达，从而发挥诱导BMSCs成骨分化的作用。

综上所述，我们认为p38MAPK信号通路参与了前列腺素E2诱导的大鼠BMSCs成骨分化的过程，其作用机制可能与上调BMP-2和Cbfα1表达有关。该研究结果为应用前列腺素E2促进骨折愈合和骨再生提供了参考依据，也为调控BMSCs成骨分化提供了作用靶点。