沉默LOXL2表达对卵巢癌SKOV3细胞生长及Wnt/β-catenin信号通路的影响

冯姗姗，郑 洪，王 凯

遵义医科大学附属医院病理科 贵州遵义 563000

卵巢癌是女性生殖道常见肿瘤之一，恶性程度高，极易发生浸润和远处转移，5 a生存率低，且近些年的发病率和死亡率呈现上升趋势，严重威胁女性的生命健康[1]。肿瘤形成与原癌基因异常表达或扩增、抑癌基因丢失等有关。赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysine oxidase-like protein 2，LOXL2)是LOX家族成员之一，定位于8p21.2-p21.3，目前多项研究[2-3]显示，LOXL2在胰腺癌、肝癌等多种肿瘤中表达明显升高，可影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学过程。有研究[4]表明，抑制LOXL2可降低卵巢癌细胞侵袭和迁移能力，但LOXL2对卵巢癌细胞凋亡的影响尚未明确。Wnt/β-catenin信号通路为经典Wnt信号通路，其异常活化已被证实参与多种人类恶性肿瘤进程，抑制卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路可抑制癌细胞生长[5]。因此，本研究旨在探讨沉默卵巢癌细胞LOXL2基因表达对癌细胞生长及Wnt/β-catenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂和仪器RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶均购自美国Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司；细胞凋亡试剂盒及流式细胞仪均购自美国BD公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；ECL显色液购自美国Thermo Fisher Scientific公司；LOXL2、β-catenin、Cyclin D1、Bax和GAPDH抗体均购自美国Abcam公司；酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2细胞培养、分组及转染正常卵巢上皮细胞IOSE80及人卵巢癌细胞SKOV3、A2780、8910和OVCAR3均购自美国ATCC公司。所有细胞用含体积分数10% FBS的RPMI 1640培养基在体积分数5% CO2、37 ℃恒温湿化培养箱中培养。每1～2 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态和融合度，当细胞达90%融合度时传代培养。采用Western blot法检测不同卵巢细胞系中LOXL2蛋白表达水平，选择LOXL2蛋白表达量最高的SKOV3细胞用于后续试验。

将SKOV3细胞分为空白对照组(未作任何处理的SKOV3细胞)、NC组(转染阴性对照siRNA)及干扰组(转染LOXL2特异性siRNA)。依据siRNA设计原则设计siRNA序列(LOXL2序列：5’-CAGU CUAUUAUAGUCACAU-3’；阴性对照序列：5’-UU CUCCGAACGUGUCACGU-3’)，由上海吉玛制药技术有限公司合成。将处于对数生长期的SKOV3细胞用含血清培养基制备成单细胞悬液，接种于6孔板，每孔2 mL细胞悬液(约1×105个细胞)，待细胞达90%以上融合度时，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司)推荐比例制备siRNA与脂质体共转染体系，混匀后室温静置20 min，加入6孔板中，6 h后，换为含血清的完全培养基。每组设3个复孔，转染48 h后观察细胞生长状态，Western blot法检测3组细胞中LOXL2蛋白表达水平，判定转染效率。

1.3各组SKOV3细胞活力的CCK-8法检测细胞培养及分组同1.2。各组SKOV3细胞用无血清培养基处理48 h后，以胰蛋白酶消化，行细胞计数，并调整细胞密度为2.0×104个/mL，以每孔100 μL细胞悬液(约2 000个细胞)接种于96孔板，4～6 h后细胞贴壁，计时为0 h，此时在每孔中加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃避光孵育1.5 h，酶联免疫检测仪测定450 nm波长各孔的吸光度值(A)。吸取细胞中反应液，加新鲜培养基继续培养24 h、48 h和72 h时，重复上述方法，测定A值。每组设3个复孔，并设置空白孔，取均值绘制生长曲线。

1.4各组SKOV3细胞凋亡的双染法检测细胞培养及分组同1.2。各组SKOV3细胞用无血清培养基处理48 h。收集细胞悬液，离心，弃掉上清液，用冷的PBS重悬细胞，离心，再用结合缓冲液重悬细胞，分别加5 μL的 Annexin V-FITC和PI，避光染色15 min，1 h内上流式细胞仪检测。每组设3个复孔。

1.5各组SKOV3细胞中LOXL2、β-catenin、Cyclin D1及Bax蛋白表达的Western blot法检测细胞培养及分组同1.2。收集3组细胞，加入适量预冷细胞裂解液，于冰上放置30 min，离心，吸取上清。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。制备50 g/L浓缩胶和120 g/L的分离胶，蛋白样品与5×上样缓冲液按照1∶3比例混匀，100 ℃煮沸变性5 min，冷却后按照30 μg/孔上样，经SDS-PAGE、转膜、封闭后，将膜放于塑封膜密封，加一抗(β-catenin、Cyclin D1、Bax和GAPDH抗体，均按1∶1 000稀释)，4 ℃摇床平缓摇动过夜，TBST洗膜，加稀释的HRP标记的二抗(按1∶2 000稀释)，室温孵育1～2 h。加ECL发光液，暗盒中用X光胶片曝光，拍照。采用Image J图像分析软件进行条带灰度值分析。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参GAPDH条带灰度值。实验重复3次。

1.6统计学处理采用SPSS 21.0进行数据分析，应用单因素方差分析和SNK-q检验比较不同类型卵巢细胞中LOXL2蛋白、各组SKOV3细胞的活力及凋亡、Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1不同类型卵巢细胞中LOXL2蛋白的表达见图1。Western blot法检测结果显示，卵巢癌SKOV3(0.352±0.036)、A2780(0.096±0.010)、8910(0.153±0.018)和OVCAR3(0.267±0.031)细胞中LOXL2蛋白表达均高于正常卵巢上皮细胞IOSE80(0.045±0.006)(F=87.131，P<0.001)；SKOV3细胞中LOXL2蛋白表达量最高。

图1 不同类型卵巢细胞中LOXL2蛋白的表达

2.2SKOV3细胞中LOXL2siRNA转染效率的检测结果见图2。干扰组LOXL2蛋白表达(0.036±0.006)低于空白对照组(0.402±0.038)和NC组(0.415±0.042)，差异有统计学意义(F=128.437，P<0.001)。

图2 各组SKOV3细胞中LOXL2蛋白的表达

2.3各组SKOV3细胞活力及细胞凋亡率的比较各组SKOV3细胞的生长曲线见图3。由图3可知，3组细胞在接种后24、48和72 h，干扰组细胞增殖活力降低，与空白对照组和NC组相比差异有统计学意义(P<0.05 )。干扰组细胞凋亡率[ (23.84±2.39)% ]高于空白对照组[ (3.14±0.22) %]和NC组[ (3.06±0.21)% ](F=222.316，P<0.001)。

图3 各组SKOV3细胞的生长曲线

2.4各组SKOV3细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达见图4和表1。与空白对照组和NC组相比，干扰组 β-catenin和Cyclin D1表达降低，Bax表达升高(P<0.05)。

图4 各组SKOV3细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的表达

表1 各组SKOV3细胞中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的比较

3 讨论

对于卵巢癌的治疗，除了常规的放化疗治疗、激素治疗、手术等，基因靶向治疗，特别是RNA干扰技术成为近些年来的研究热点，且取得了一定的效果[6]。RNA干扰是近些年发展起来的一项沉默基因表达的新技术，具有可同时抑制多个基因、抑制效果好、特异性强等优势，在肿瘤基因治疗领域有广阔应用前景[7-8]。

LOXL2是LOX家族成员之一。有研究[9]发现，LOXL2在胎盘组织、子宫、前列腺中高表达，而在心、肾、肺等其他组织呈现低表达。有关LOXL2的研究[10]表明，LOXL2基因是肿瘤抑制的候选基因。然而，越来越多的研究[11-12]显示，LOXL2在多种肿瘤中呈现高表达，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭迁移、血管生成及抑制凋亡，因此，更应该作为肿瘤促进因子。近些年的多项研究[4，13]也表明，抑制LOXL2的表达可降低肿瘤细胞生长：如抑制LOXL2的表达可降低卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力；LOXL2 siRNA可通过下调MMP-2和MMP-9的表达来抑制胃癌细胞的侵袭能力。本研究首先检测了不同卵巢癌细胞及正常卵巢上皮细胞中LOXL2蛋白的表达，发现卵巢癌中LOXL2蛋白的表达均高于正常卵巢上皮细胞，且SKOV3细胞中LOXL2蛋白表达最高；将设计合成的LOXL2 siRNA转染SKOV3细胞后，发现细胞增殖能力降低、凋亡率升高，提示LOXL2可能是卵巢癌治疗潜在的分子靶点之一。

Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞增殖、分化的关键信号途径，在肿瘤发生发展、转移及胚胎发育等过程中有关键作用，研究[14-15]表明，Wnt/β-catenin信号通路在卵巢上皮性癌和前列腺癌中呈现高表达，因此寻找抑制该信号途径的有效方法已成为研究热点。Wnt信号通路被激活可抑制β-catenin-AXIN-APC-GSK3复合物形成，从而抑制β-catenin磷酸化，未发生磷酸化的β-catenin转位入核，促进LEF/TCF激活Cyclin D1、Survivin、Bax等下游靶基因表达，从而在肿瘤形成及发展中发挥作用[16-17]。多项研究[18-19]显示：抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制卵巢癌细胞生长或促进其凋亡，如丹皮酚可抑制人卵巢癌细胞增殖并促进其凋亡，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号转导通路有关；miR-218可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路促进卵巢癌细胞凋亡。本研究结果显示，沉默LOXL2表达可下调卵巢癌细胞β-catenin和Cyclin D1表达，上调促凋亡基因Bax表达。提示LOXL2可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路影响卵巢癌细胞生长。

综上所述，沉默LOXL2表达可抑制卵巢癌细胞活力，诱导细胞凋亡，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，提示在卵巢癌诊疗中LOXL2可能是有效靶点之一，但目前本研究及以往的相关研究有限，还需更多理论及临床试验支持。