超声波辅助纤维素酶提取核桃壳多糖及其抗氧化活性研究

汤慧民，周丽菊

(文山学院 化学与工程学院，云南 文山 663099)

核桃属于胡桃科核桃属，素有木本油料之王之称，位居世界四大干果之首[1]。2017年全国核桃总产量达415万t，按核桃壳质量占核桃总质量的30%计算，2017年核桃壳产量约124.5万t[2]。核桃壳多数被焚烧或丢弃，不仅污染环境，而且也造成资源的大量浪费。研究发现核桃壳含有酚酸类、黄酮类、苷类等多种活性物质，具有抗氧化、抗菌、降脂、抗肿瘤等作用[3]。目前对核桃壳多糖的相关研究较少。本研究采用超声波辅助纤维素酶法从核桃壳中提取多糖，并优化其提取条件，同时对所提取的核桃壳多糖进行抗氧化活性的测定，为进一步实现工业化生产奠定坚实基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

核桃，云南省文山州广南县薄壳核桃；纤维素酶、无水葡萄糖、95%乙醇、石油醚、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、硫酸、苯酚、抗坏血酸、水杨酸、邻苯三酚、盐酸、30%过氧化氢、硫酸亚铁、DPPH、Tris，均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

FW135型高速万能粉碎机；SK-18TC超声波清洗器，上海科岛超声仪器有限公司；V-1100D型可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；AL电子天平；DHG-9023A电热鼓风干燥箱；800型离心机；HH-2数显恒温水浴锅；RE-2000A型旋转蒸发仪；SHB-III循环式多用真空泵；SCIENTZ-10N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 核桃壳多糖的提取

将核桃去仁取壳后清洗，75℃干燥2 h，粉碎过60目筛，按料液比1∶30加入石油醚，在恒温水浴锅中65℃回流2 h脱脂，再按料液比1∶30加入80%乙醇回流2 h除去单糖和寡糖，然后抽滤干燥。按一定料液比加入蒸馏水溶解，用磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液调节溶液的pH为4.8，再加入适量的纤维素酶，在一定温度、时间和超声波功率下进行超声处理，然后在95℃沸水浴中灭酶15 min，冷却后离心分离，过滤除去杂质，取上清液浓缩至原体积的1/4，通过Sevage法沉淀除去蛋白，离心，取上清液用3倍体积无水乙醇沉淀核桃壳多糖，并在冰箱中4℃下过夜后抽滤，将滤液减压浓缩后冷冻干燥，即得到核桃壳多糖。

1.2.2 标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的无水葡萄糖100.0 mg，加蒸馏水溶解并转移到100 mL容量瓶中定容，得到质量浓度为1 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。准确移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL葡萄糖标准溶液于100 mL容量瓶中定容。再分别移取2.0 mL葡萄糖溶液至试管中，加入1.0 mL质量分数为5%的苯酚溶液和5.0 mL浓硫酸，混匀。在70℃ 的恒温水浴中加热15 min，然后用自来水冷却15 min，在490 nm波长处测定吸光度[4-6]。以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制得到葡萄糖标准曲线，回归方程为：y=6.735 7x-0.003 2,R2=0.999 7。

1.2.3 核桃壳多糖含量的测定及提取率的计算

准确移取2.0 mL核桃壳多糖提取液(1.2.1中除去蛋白的上清液)于具塞试管中，加入1.0 mL质量分数为5%的苯酚溶液，摇匀，再缓慢加入5.0 mL浓硫酸,摇匀后置于70℃水浴中加热15 min,取出后用自来水冷却15 min，用蒸馏水按同样的操作作空白对照，用可见分光光度计于490 nm波长处测定其吸光度，平行测定3次，取平均值[5-6]。由标准曲线回归方程计算样品的多糖含量。多糖提取率按下式计算。

式中：C为核桃壳提取液中多糖含量，mg/mL；V为核桃壳多糖提取液总体积，mL；M为核桃壳粉的质量，g。

1.2.4 核桃壳多糖的抗氧化活性研究

1.2.4.1 核桃壳多糖对DPPH自由基的清除能力测定[7]

采用95%乙醇配制2.0×10-4mol/L的DPPH 乙醇溶液，现配现用。

向3.0 mL DPPH乙醇溶液中分别加入3.0 mL不同质量浓度(0.055、0.110、0.165、0.220、0.275 mg/mL)的核桃壳多糖溶液，摇匀，在室温条件下反应20 min，然后在517 nm波长处测定吸光度(Ai),同时测定3.0 mL DPPH乙醇溶液与3.0 mL蒸馏水混合后溶液的吸光度(Ac),以及3.0 mL 95%乙醇与3.0 mL不同质量浓度(0.055、0.110、0.165、0.220、0.275 mg/mL)的核桃壳多糖溶液混合后溶液的吸光度(Ab)。同时，以维生素C作阳性对照，每组重复3次并取平均值。核桃壳多糖溶液对DPPH自由基的清除率按下式计算。

1.2.4.2 核桃壳多糖对羟基自由基的清除能力测定[8]

取不同质量浓度(0.055、0.110、0.165、0.220、0.275 mg/mL)的核桃壳多糖溶液3.0 mL于试管中，分别加入硫酸亚铁溶液(9 mmol/L)和水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)各2.0 mL，再加入3.0 mL过氧化氢溶液(8.8 mmol/L)，最后用蒸馏水定容至10 mL，在37℃恒温水浴锅中反应20 min后，在510 nm波长处测定吸光度，用蒸馏水作空白对照。以维生素C作阳性对照，每组试验重复3次并取平均值。核桃壳多糖溶液对羟基自由基的清除率按下式计算。

式中：A0为空白溶液的吸光度；Ax为加入核桃壳多糖溶液的吸光度；Ax0为不加过氧化氢溶液的吸光度。

1.2.4.3 核桃壳多糖对超氧阴离子自由基的清除能力测定[9]

取5.0 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 8.2)缓冲溶液置于试管中，加入3.0 mL蒸馏水，在25℃恒温水浴锅中反应10 min，然后分别加入3.0 mL不同质量浓度(0.055、0.110、0.165、0.220、0.275 mg/mL)的核桃壳多糖溶液，再加入2.0 mL邻苯三酚溶液(25 mmol/L)，混匀后置于25℃恒温水浴锅中反应15 min，立即加入2.0 mL盐酸(10 mmol/L)终止反应，在320 nm波长处测定吸光度(Ai)。以维生素C作阳性对照，对照组用蒸馏水代替邻苯三酚测定吸光度(Aj)，空白组用蒸馏水代替核桃壳多糖溶液测定吸光度(A0)，每组试验重复3次并取平均值。核桃壳多糖溶液对超氧阴离子自由基的清除率按下式计算。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对核桃壳多糖提取率的影响

称取5.0 g核桃壳干粉，在纤维素酶添加量为1.75%、pH为4.8、提取温度为50℃、提取时间为120 min、超声波功率为600 W的条件下，比较不同料液比对核桃壳多糖提取率的影响，结果见图1。

图1 料液比对核桃壳多糖提取率的影响

由图1可以看出：随着料液比的增大，核桃壳多糖提取率增大；料液比超过1∶30时，核桃壳多糖提取率下降。原因可能是增加溶剂使用量可以增大固液接触面积，有利于扩散，核桃壳多糖提取率上升；但过度增大料液比不仅造成溶剂浪费，亦会导致样品中其他杂质成分溶出。综合考虑，适宜的料液比为1∶30。

2.1.2 纤维素酶添加量对核桃壳多糖提取率的影响

称取5.0 g核桃壳干粉，在料液比为1∶30、pH为4.8、提取温度为50℃、提取时间为120 min、超声波功率为600 W的条件下，比较不同纤维素酶添加量对核桃壳多糖提取率的影响，结果见图2。

由图2可以看出：随着纤维素酶添加量的增大，核桃壳多糖提取率增加；纤维素酶添加量超过1.75%时，核桃壳多糖提取率不再增加。纤维素酶可破坏细胞壁，加速多糖的溶出，但当纤维素酶添加量大于一定量时，底物已经处于酶饱和状态[10]，多糖提取量趋于平缓。因此，最佳的纤维素酶添加量为1.75%。

图2 纤维素酶添加量对核桃壳多糖提取率的影响

2.1.3 提取时间对核桃壳多糖提取率的影响

称取5.0 g核桃壳干粉，在料液比为1∶30、酶添加量为1.75%、pH为4.8、提取温度为50℃、超声波功率为600 W的条件下，比较不同提取时间对核桃壳多糖提取率的影响，结果见图3。

图3 提取时间对核桃壳多糖提取率的影响

由图3可以看出：随着提取时间的延长，核桃壳多糖提取率逐渐增加；当提取时间为120 min时，核桃壳多糖提取率最大；之后随着提取时间的继续延长，核桃壳多糖提取率呈下降趋势。原因可能是由于长时间超声作用使部分多糖被超声波的剪切力降解以及非糖类杂质溶出过多，影响多糖提取率[11]。因此，适宜的提取时间为120 min。

2.1.4 提取温度对核桃壳多糖提取率的影响

称取5.0 g核桃壳干粉，在料液比为1∶30、纤维素酶添加量为1.75%、pH为4.8、提取时间为120 min、超声波功率为600 W的条件下，比较不同提取温度对核桃壳多糖提取率的影响，结果见图4。

由图4可以看出：随着提取温度的升高，核桃壳多糖提取率不断增大；当提取温度为50℃时，核桃壳多糖提取率达到最大；之后随着提取温度的继续升高，核桃壳多糖提取率下降。原因可能是温度过高，会破坏酶结构，使酶失去活性；温度过低，酶催化作用不能充分发挥[12]。因此，适宜的提取温度为50℃。

图4 提取温度对核桃壳多糖提取率的影响

2.1.5 超声波功率对核桃壳多糖提取率的影响

称取5.0 g核桃壳干粉，在料液比为1∶30、纤维素酶添加量为1.75%、pH为4.8、提取时间为120 min、提取温度为50℃的条件下，比较不同超声波功率对核桃壳多糖提取率的影响，结果见图5。

图5 超声波功率对核桃壳多糖提取率的影响

由图5可以看出：随着超声波功率的增大，核桃壳多糖提取率不断增大；当超声波功率增大到675 W时，核桃壳多糖提取率最大，之后下降。这是因为随着超声波功率的增加，增大了超声的空化及机械搅拌作用，促进了多糖的溶出；但超声波功率过大，容易造成提取系统局部瞬时过热，从而造成多糖分子链的断裂[13]。因此，适宜的超声波功率为675 W。

2.2 正交试验

通过单因素试验，固定纤维素酶添加量为1.75%，以料液比、提取温度、提取时间、超声波功率作为影响核桃壳多糖提取率的主要因素，以多糖提取率为指标，设计L9(34)正交试验优化提取条件。正交试验因素与水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

由表2可知，影响核桃壳多糖提取率的主次顺序为A>B>C>D，即料液比>提取温度>提取时间>超声波功率。最佳提取工艺条件为A1B1C1D3，即料液比1∶20、提取温度45℃、提取时间90 min、超声波功率750 W。在最优工艺条件下进行验证试验，平行测定3次，核桃壳多糖提取率分别为2.13%、2.21%、2.25%，平均值为2.20%，RSD为2.78%。

表1 正交试验因素与水平

表2 正交试验设计及结果

2.3 核桃壳多糖的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH自由基的能力(见图6)

图6 核桃壳多糖和维生素C对DPPH自由基的清除率

由图6可以看出：虽然核桃壳多糖对DPPH自由基的清除能力低于维生素C，但是随着质量浓度的增加，核桃壳多糖的DPPH自由基清除率呈现上升趋势；在质量浓度为0.275 mg/mL时，核桃壳多糖的DPPH自由基清除率达到40.60%。说明核桃壳多糖对DPPH自由基有一定的清除能力。

2.3.2 清除羟基自由基的能力(见图7)

由图7可以看出：核桃壳多糖的羟基自由基清除率略低于维生素C的；随着质量浓度的增加，核桃壳多糖的羟基自由基清除率呈现缓慢上升趋势，在质量浓度为0.275 mg/mL时，其羟基自由基清除率达到91.79%。说明核桃壳多糖对羟基自由基有很强的清除能力。

图7 核桃壳多糖和维生素C对羟基自由基的清除率

2.3.3 清除超氧阴离子自由基的能力(见图8)

图8 核桃壳多糖和维生素C对超氧阴离子自由基的清除率

由图8可以看出：核桃壳多糖对超氧阴离子自由基的清除能力低于维生素C，但是随着质量浓度的增加，核桃壳多糖的超氧阴离子自由基清除率呈现上升趋势；在质量浓度为0.275 mg/mL时，核桃壳多糖的超氧阴离子自由基清除率达到77.30%。说明核桃壳多糖对超氧阴离子自由基有较强的清除能力。

3 结 论

采用单因素试验和正交试验对超声波辅助纤维素酶提取核桃壳多糖的工艺条件进行优化，得到的最优工艺条件为料液比1∶20、纤维素酶添加量1.75%、提取温度45℃、提取时间90 min、超声波功率750 W，在此条件下核桃壳多糖的提取率为2.20%。核桃壳多糖对羟基自由基具有很强的清除能力，对超氧阴离子自由基具有较强的清除能力，对DPPH自由基具有一定的清除能力，在质量浓度为0.275 mg/mL时，对三者的清除率分别达到91.79%、77.30%、40.60%。表明核桃壳多糖具有良好的抗氧化活性。