啤酒花的HPLC指纹图谱建立及其抗氧化作用谱效关系研究

刘晓燕 蒋益萍 张嘉宝 王娜妮 辛海量

中图分类号R931

文献标志码A

文章编号1001-0408（2020）02-0138-06

DOI

10.6039/j .issn.1001-0408.2020.02.03

摘要 目的：建立啤酒花的高效液相色谱（ HPLC）指纹图谱，并考察与其抗氧化作用的相关性。方法：色谱柱为DiamonsilC18，流动相为0.1%磷酸水溶液一乙腈（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，检测波长为358 nm，进样量为2μL。以黄腐酚峰为参照，绘制11批啤酒花药材样品的HPLC指纹图谱;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行相似度评价，确定共有峰;以1，1-二苯基一2一三硝基苯肼（DPPH）自由基清除率、2，2-连氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）自由基清除率为抗氧化作用的药效指标，采用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘回归分析以建立谱效关系，并进行体外抗氧化试验验证。结果：11批啤酒花药材样品共有19个共有峰，相似度均大于0.830。共指认出7个成分，分别为黄腐酚、类律草酮、律草酮、加律草酮、类蛇麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮。11批啤酒花均具有清除DPPH和ABTS自由基的作用。谱效关系分析结果显示，啤酒花中黄腐酚、律草酮、类蛇麻酮峰与其抗氧化能力呈正相关，且变量投影值均大于1。体外抗氧化验证结果显示，0.1 mg/mL黄腐酚与0.01 mg/mL维生素C对DPPH自由基的清除作用相当，但10.0 mg/mL黄腐酚对ABTS自由基清除作用小于0.1 mg/mL维生素C。结论：所建HPLC指纹图谱可用于评价啤酒花的质量;黄腐酚、律草酮和类蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物质基础。

关键词 啤酒花;高效液相色谱法;指纹图谱;抗氧化;谱效关系;偏最小二乘法回归分析

啤酒花（Humulus lupulus L.）为桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，主要分布于我国新疆地区，以未成熟的雌性球穗花序入药，具有健胃消食、安神、利尿等功效，可用于治疗肺结核、癔病、失眠、膀胱炎等症[1]，在我国作为民族药收载于1977年版《中国药典》（一部）、《新疆药用植物志》和《宁夏中药志》等多部典籍。各典籍均记载了啤酒花的基源和功能主治内容，但仅有药典记载了采用滴定法测定啤酒花浸膏中啤酒花软树脂的含量[2-4]。啤酒花含有黄酮类、树脂类、挥发油、多酚类及多糖类等多种活性成分[5]，而仅靠滴定法不能全面控制啤酒花中多种活性成分的含量，且目前对于啤酒花的研究大多为对其多酚类或黄酮类成分的分离和结构分析，具有一定的局限性[6-8]。

中药谱效学是基于解决中药活性成分复杂、药理作用机制不明等问题的一门学科，也是中药学质量和活性研究的一个新方向，其可利用多种数据分析中药药理活性的物质基础[9]。啤酒花中的黄酮类成分黄腐酚及多酚类成分均具有抗氧化活性[10-11]，但目前尚未见关于啤酒花中各成分与其抗氧化活性的研究。基于此，本研究采用高效液相色谱（HPIC）法建立了啤酒花的指纹图谱，并对其指纹图谱中的特征峰与清除1，l-二苯基-2 -三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-连氨-（3一乙基苯并噻唑啉-6一磺酸）二氨盐（ABTS）自由基作用的相关性进行分析，探讨特征峰与其抗氧化活性的相关性，以阐明其体外抗氧化活性的物质基础，旨在为其质量控制和抗氧化作用谱效关系研究提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AD型HPLC仪，包括四元梯度系统、二极管阵列检测器、LC-solution色谱工作站（日本岛津株式会社）;AG285型万分之一电子分析天平（瑞士Mettler-To-ledo公司）;DL-1OOOB型智能超声波清洗仪（上海之信仪器有限公司）;ELx 800型多功能酶标仪（美国Biotek公司）。

1.2 试剂

黄腐酚对照品（上海历鼎生物技术有限公司，批号：20181103.纯度：≥98%）;啤酒花浸膏ICE-3（美国酿造化学家协会，含有类葎草酮、葎草酮、加葎草酮、类蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮等6种成分）;维生素C[生工生物工程（上海）股份有限公司，批号：RS032884013J，纯度：≥99%];DPPH（批号：STBD2362V）、ABTS（批号：SLBV6099）均由美国Sigma公司提供;甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

1.3 药材

啤酒花药材（编号：S1～S11）经解放军海军军医大学药学院生药教研室辛海量副教授鉴定为桑科植物啤酒花（H lupulus L.）的雌性球穗花序。药材样品来源信息见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C.8（250 mm×4.6 mm，5μm）;流动相：0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10min， 20% B→25%B; 10～12 min， 25%B→ 75%B; 12～30 min， 75%B→78% B; 30～40 min， 78% B→81% B;40～42 min， 81% B→83%B： 42～60 min， 83% B→90%B）;流速：1.O mL/min;柱溫：30℃;检测波长：358 nm;进样量：2 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液精密称取黄腐酚对照品26.46mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得黄腐酚对照品贮备液。精密称取啤酒花浸膏ICE-3466.27 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，得浸膏贮备液。取上述两种贮备液各5 mL，置于同- 10 mL量瓶中，混合均匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液取啤酒花药材样品适量，粉碎，称取粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加50%乙醇20 mL，称定质量，超声（功率：300W，頻率：50 kHz）处理30 min，放凉至室温，再次称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：SII）适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，以黄腐酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.13%（n=6），相对峰面积的RSD均小于1.47%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 稳定性试验取“2.2.2”项下供试品溶液（编号：S11）适量，分别于室温下放置O、2、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，以黄腐酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.37%（n=7），相对峰面积的RSD均小于2.93%（n=7），表明供试品溶液于室温下放置24 h内稳定性良好。

2.3.3 重复性试验取啤酒花药材样品粉末（编号：S11）0.5 g，共6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，以黄腐酚峰的保留时间和峰面积为参照，记录各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果，19个共有峰相对保留时间的RSD均小于0.41%（n=6），相对峰面积的RSD均小于2.17%（n=6），表明该方法重复性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成与相似度、共有峰分析

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成取11批啤酒花药材样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对11批啤酒花药材样品的指纹图谱进行分析，得HPLC指纹图谱，详见图1、图2。

2.4.2 相似度评价采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）进行相似度评价。结果，11批啤酒花药材样品的相似度均大于0.830，提示不同产地和不同品种的啤酒花药材样品间的化学成分差异较小。相似度评价结果见表2。

2.4.3 共有峰的指认11批啤酒花药材样品共有19个共有峰。以SIO作为参照图谱，时间窗口为0.1 min，选择指纹图谱中峰形较好的色谱峰进行多点校正，采用平均数法生成对照图谱，同时结合啤酒花药材样品和混合对照品的HPLC分析结果，指认出11号峰为黄腐酚、13号峰为类葎草酮、14号峰为葎草酮、15号峰为加葎草酮、17号峰为类蛇麻酮、18号峰为蛇麻酮、19号峰为加蛇麻酮，详见图3。因黄腐酚峰分离度良好、峰面积大且稳定，故以其保留时间和峰面积为参照，计算其他峰的相对保留时间和相对峰面积，详见表3、表4。

2.5 抗氧化作用考察

2.5.1 DPPH自由基清除率 按“2.2.2”项下方法制备11批供试品溶液（编号：S1～11），每批取1 mL，加50%乙醇稀释制成系列质量浓度的供试品溶液;精密称取DPPH 4 mg，加甲醇溶解并定容至100 mL量瓶中，即得浓度为40 μg/mL的DPPH自由基溶液。取上述系列质量浓度的供试品溶液各100 μL、DPPH自由基溶液100μL，先后加入至96微孔板中，置于室温避光处反应30min后，采用酶标仪于540 nm波长处测定DPPH自由基溶液+系列质量浓度供试品溶液的吸光度（As）;取系列质量浓度的供试品溶液各100 μL、无水乙醇100 μL，同法反应并测得系列质量浓度供试品溶液的吸光度（Ac）;取DPPH自由基溶液100 μL、50%乙醇溶液100 μL，同法反应并测得DPPH自由基溶液的吸光度（A0）。上述试验均平行操作3次，取平均值，按公式计算DPPH清除率：DPPH清除率=[A0-（As一Ac）]/A0×1OO%[12-14];采用GraphPad Prism 5软件进行非线性回归，预测半数抑制浓度（ICso），结果见表5。由表5可知，11批啤酒花药材样品均具有清除DPPH自由基的能力，其中以昌吉市吉木萨尔县红旗农场1采集的啤酒花（编号：S4）抗氧化能力最强。

2.5.2 ABTS自由基清除率 精密称取ABTS 38.41mg，加水溶解并定容至10 mL量瓶中，制成浓度为7mmol/L的ABTS水溶液，与2.45 mmol/L的过硫酸钾（K2S208）水溶液混合，于暗处放置12 h以上，使用前加甲醇稀释，使其在734 nm波长处的吸光度为0.78～0.82，即得ABTS自由基溶液。取“2.5.1”项下系列质量浓度的供试品溶液各10 μL、ABTS自由基溶液200 μL，先后加入至96微孔板中，置于室温反应10 min，采用酶标仪于734 nm波长处测得ABTS自由基溶液+系列质量浓度供试品溶液的吸光度（As）;取系列质量浓度的供试品溶液10 μL、甲醇200 μL，同法反应并测得系列质量浓度供试品溶液的吸光度（Ac）;取ABTS自由基溶液200μL、50%乙醇溶液10 μL，同法反应并测得ABTS自由基溶液的吸光度Ao。上述试验均平行操作3次，取平均值，按“2.5.1”项下公式计算ABTS清除率并预测ICso，结果见表5。由表5可知，11批啤酒花药材样品均具有清除ABTS自由基的能力，其中以阿勒泰市云母二矿采集的啤酒花（编号：S2）抗氧化能力最强。

2.6 谱效关系分析

以表5中11批啤酒花药材样品的抗氧化活性数据为因变量，峰面积为自变量，采用SIMCA 14.1软件进行偏最小二乘回归分析。结果，啤酒花药材样品HPLC指纹图谱中的4～12、14、16～18号峰面积与其清除DPPH和ABTS自由基的能力呈正相关，即相应成分的相对含量越高，其清除DPPH和ABTS自由基的能力越强，提示该成分是啤酒花清除DPPH和ABTS自由基作用的物质基础，结果见图4。

变量投影（VIP）可解释自变量对因变量的贡献程度，VIP值越大，说明该自变量对因变量的贡献越大，VIP>I时表示对因变量有显著貢献[15]。以DPPH和ABTS自由基的清除率为药效指标，对VIP进行分析，筛选出对啤酒花药材样品抗氧化能力影响较大的色谱峰（以VIP>1为标准）。结果，啤酒花药材样品对DPPH和ABTS自由基的清除能力从大到小依次分别为黄腐酚（11号峰）>葎草酮（14号峰）>类蛇麻酮（17号峰）和葎草酮（14号峰）>黄腐酚（11号峰）>类蛇麻酮（17号峰），提示相应成分在清除DPPH和ABTS自由基过程中具有重要作用，且与啤酒花抗氧化能力呈正相关，进一步提示黄腐酚、葎草酮和类蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物质基础，结果见图5。

2.7 黄腐酚体外抗氧化验证试验

2.7.1 DPPH自由基清除率精密称取黄腐酚对照品50.04 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL量瓶中;另取上述溶液适量，再分别用甲醇稀释10、100倍，制成质量浓度分别为10.0、1.0、0.1 mg/mL的系列工作溶液。精密称取维生素C 10 mg，加水溶解并定容至100 mL量瓶中，制成质量浓度为0.01 mg/mL的维生素C溶液。按“2.5.1”项下方法操作并计算黄腐酚和维生素C对DPPH自由基的清除率，详见图6A。由图6A可知，黄腐酚在质量浓度0.1～10.O mg/mL范围内对DPPH自由基的清除率由42.6%增加至88.8%，且0.1 mg/mL黄腐酚与0.01 mg/mL维生素C对DPPH自由基的清除率相当（P=0.050），提示黄腐酚具有较强的清除DPPH自由基的能力，是啤酒花具有清除DPPH自由基作用的主要成分之一。

2.7.2 ABTS自由基清除率取“2.7.1”项下系列工作溶液各适量;另精密称取维生素C 10.02 mg，加水溶解并定容至10 mL量瓶中，制成质量浓度为0.1 mg/mL的维生素C溶液。按“2.5.1”项下方法操作计算黄腐酚和维生素C对ABTS自由基的清除率，详见图6B。由图6B可知，在质量浓度0.1～10.O mg/mL范围内，以10.O mg/mL的黄腐酚对ABTS自由基的清除率最高，为33.5%，但小于0.1 mg/mL维生素C对ABTS自由基的清除率;结合图5B，提示啤酒花药材样品在清除ABTS自由基时葎草酮的作用最大，是其具有清除ABTS自由基作用的主要成分之一。

3 讨论

本研究采用HPLC法建立了啤酒花药材样品的指纹图谱，该方法精密度高、稳定性好、重复性好，能够同时检测啤酒花中的多种有效成分。本研究前期分别考察了乙腈一水、甲醇一水不同流动相系统的分离效果，结果显示，以乙腈一水为流动相时的分离效果优于甲醇一水，但存在色谱峰拖尾现象;随后在水相中加入0.1%磷酸后，色谱峰的拖尾现象得到改善。

DPPH法和ABTS法是常用的检测化合物或植物提取物抗氧化活性的方法[16]，因此本研究以DPPH和ABTS自由基的清除率来评价啤酒花药材样品的抗氧化能力。结果显示，11批啤酒花药材样品均具有清除DPPH和ABTS自由基的能力，分别以昌吉市吉木萨尔县红旗农场1和阿勒库市云母二矿采集的啤酒花药材样品的抗氧化能力最强。

偏最小二乘回归法主要用于多因变量对多自变量的回归建模[17]，能较好地解决样本量少于变量的问题[18]。本研究采用偏最小二乘回归法分析了啤酒花药材样品色谱峰与其抗氧化作用的相关性。结果显示，啤酒花药材样品指纹图谱中黄腐酚（11号）、葎草酮（14号）、类蛇麻酮（17号）与DPPH和ABTS自由基清除率呈正相关，推测上述3种成分可能为啤酒花药材样品具有抗氧化作用的潜在药效物质。体外抗氧化验证试验结果显示，0.1 mg/mL黄腐酚与0.01 mg/mL维生素C对DPPH自由基的清除率相当，但10.0 mg/mL黄腐酚对ABTS自由基清除率小于0.1 mg/mL维生素C。

综上所述，本研究所建HPLC指纹图谱可用于评价啤酒花的质量，黄腐酚、葎草酮和类蛇麻酮可能是啤酒花具有抗氧化作用的物质基础。

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（收稿日期：2019-06-27修回日期：2019-12-10）

（编辑：陈宏）

△基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.U1603283）

*硕士研究生。研究方向：中药药理学。E-mail：nmulxy@163，com

#通信作者：副教授，硕士生导师，博士。研究方向：中药资源、中药（抗骨质疏松）药理学。电话：021-81871300。E-mail：hailiangxin@163.com