ADSC-CM干预对小型猪肝损伤模型中内质网应激的影响

刘笑凝，焦智慧，马亚军，张千振，徐嘉元，朴晨曦，张建涛，王洪斌

(东北农业大学 动物医学学院 黑龙江省普通高等学校动物普通疾病防治重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030)

内质网是真核细胞内蛋白质、糖类和脂类等生物大分子合成的主要场所，在蛋白质翻译后的加工修饰、运输和折叠过程中起关键性作用[1]。当受到内外环境刺激时，细胞内微环境发生改变，内质网功能出现紊乱，导致错误折叠或未折叠的蛋白质大量蓄积在内质网中，进而引发细胞一系列的适应性反应，称为内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[2]。GRP78蛋白是热休克蛋白70家族成员，具有两个结构域。在生理状态下，位于内质网膜上的GRP78蛋白同内质网上3类跨膜蛋白(ATF6、PERK和IRE1)结合处于无活性状态。当ERS发生时，GRP78蛋白会感受并结合未折叠或错误折叠的蛋白形成复合物，同时与上述3类感受蛋白解离，激活3条ERS信号转导通路ATF6、PERK和IRE1[3]。适度的ERS有助于机体应对微环境改变，但长期的ERS会激活下游ATF4-CHOP等凋亡通路，诱导细胞凋亡。

在肝切除术和肝移植术这类需要阻断肝蒂血流的复杂肝脏手术中，原本缺血时受损的肝细胞，在血供恢复后损伤非但没有减轻，反而出现加重的现象，称为肝脏缺血再灌注 (ischemia-reperfusion,I/R)损伤[4-5]。由于肝脏I/R会进一步加剧肝脏的额外损伤，所以对于如何有效减轻手术过程中的肝脏I/R损伤成为了临床上亟待解决的问题。近年的大量研究表明，造成肝脏I/R损伤的主要损伤因子如能量代谢紊乱、钙超载以及氧化应激都会激活ERS，这表明ERS在肝脏I/R损伤中发挥了重要作用[6]。长时间的ERS会严重影响肝细胞的功能，甚至诱导肝细胞凋亡加剧肝脏损伤。因此若对ERS信号传导途径加以干预，或许是减轻肝脏I/R损伤的有效策略。

干细胞由于其特殊的多向分化潜能和自我复制能力，在临床上具有广阔的应用前景。而脂肪间充质干细胞(ADSCs)除了其潜在的分化功能外，已被证实可在外伤、缺血、炎症等病理过程中发挥保护作用[7]。以往研究表明干细胞主要靠分化作用和旁分泌作用发挥其生理保护效应，而近年来多项研究发现干细胞在移植靶点的移植率和存活率均较低，所以现在倾向于认为干细胞的作用机制主要依靠其旁分泌效应，通过释放可溶性分子减轻损伤和促进组织的再生恢复[8]。另外相对于传统的干细胞移植，通过处理间充质干细胞旁分泌产物提取的条件培养液在临床使用上具有安全和易运输保存的优点[9]。然而脂肪间充质干细胞条件培养液(adipose tissue-derived mesenchymal stem cell condition medium，ADSC-CM)能否抑制肝脏I/R损伤所致的 ERS，从而减轻肝脏的损伤，尚且需要进一步探究。

腹腔镜手术具有创伤小、术后恢复快和并发症少的优点，在临床肝脏手术中应用广泛[10]。本试验应用腹腔镜技术建立ADSC-CM干预小型猪肝脏I/R合并部分肝切除损伤模型，观察ADSC-CM干预后肝脏组织病理学以及肝细胞ERS各指标的变化情况，探讨ADSC-CM对小型猪肝脏I/R合并部分肝切除损伤模型的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1试验动物 4～6月龄广西巴马小型猪24头，体质量20～30 kg，相同条件下饲养1个月，经临床和实验室检查确认健康后用于试验。

1.1.2试验细胞 试验过程中所用小型猪脂肪间充质干细胞由东北农业大学动物医学学院外科教研室腹腔镜课题组提供，已经诱导成肝、成脂、成骨分化鉴定多向分化能力，细胞流式鉴定表面分子标记物，确定为小型猪脂肪间充质干细胞[11]。

1.1.3主要仪器与试剂 高清医用内窥镜摄像系统、医用内窥镜冷光源均购自深圳神州医疗设备有限公司；腹腔镜手术基本设备、医用CO2气腹机、医用高频电刀USE-30型均购自Olympus公司；实时荧光定量PCR仪LightCycler480 Ⅱ购自德国罗氏诊断仪器公司；改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,Low Glucose,L-DMEM)购自美国Inyitrogen生命技术有限公司；胎牛血清(FBS)购自美国CLARK公司；小型猪复合麻醉剂(XFM)由东北农业大学兽医外科教研室配制；丙泊酚注射液购自西安力邦制药有限公司；硫酸阿托品注射液购自新乡市常乐制药有限责任公司；Trizol试剂购自Invitrogen公司；反转录和PCR试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1ADSC-CM的制备 取P4脂肪间充质干细胞于T75细胞培养瓶中，用含10% FBS和1%青链霉素以及1%谷氨酰胺的L-DMEM培养细胞至密度80%～90%，换用新鲜无血清L-DMEM，饥饿培养48 h;收集上清至50 mL无菌离心管中，1 500 r/ min离心10 min，吸取上清至新的无菌离心管中，以0.22 μm滤器过滤除菌，吸取过滤后的ADSC-CM于3 000超滤离心管中，5 000 r/min 4℃离心40 min，-80℃保存ADSC-CM浓缩液，使用时37℃预温。

1.2.2试验分组与手术建模 将24头小型猪随机分为模型组、基础培养基对照组(DMEM组)、脂肪间充质干细胞条件培养液组(ADSC-CM组)和脂肪间充质干细胞组(ADSCs组)，每组6头。术前禁食24 h，禁水12 h。参照文献 [11]，在腹腔镜下进行右半肝缺血60 min合并左半肝切除手术。模型组、基础培养基组和条件培养液组于断面边缘1 cm左右分点分别注射等量生理盐水、基础培养基及条件培养液。检查断面有无出血，清洗腹腔后将离断肝组织装袋取出，缝合腹壁，碘酊消毒，术后加强护理。各组于术前、术后1，3，7 d经腹腔镜手术取肝脏组织，分为2份，一份用4%甲醛固定，另一份-80℃保存待检。

1.2.3肝脏组织HE切片观察 取各组采集的经4%甲醛固定的小块肝脏组织，常规石蜡包埋处理后进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。

1.2.4RT-PCR检测ERS各指标基因表达的变化 总RNA的提取及cDNA的合成：取各组冻存组织加入Trizol试剂研磨，经氯仿抽提，异丙醇沉淀，75%乙醇漂洗沉淀后，将获取的总RNA按反转录试剂盒说明书反转录为cDNA。引物的设计和合成：参照 NCBI中猪基因序列，采用 Primer Premier 5.0软件设计了GRP78、PERK、IRE1、ATF6、ATF4和CHOP特异性引物，引物序列见表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实时荧光定量PCR：PCR反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6.4 μL，荧光染料混合物10 μL。PCR反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环；融解分析95℃ 5 s，60℃ 1 min,升温至95℃；50℃ 30 s降温。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算各因子相对表达量。

表1 引物序列信息

1.3 数据处理采用SPSS软件进行数据分析，采用单因素方差分析进行方差处理，采用LSD检验进行两两多重比较，结果以平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 肝脏组织病理学观察由图1可知，模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组术前组织肝小叶结构完整，肝细胞呈索状规则排列，无坏死迹象。模型组和DMEM组在术后1，3和7 d可见不同程度肝脏组织损伤：肝细胞排列混乱，细胞肿胀严重，多见空泡变性，并存在炎性细胞浸润和坏死性病变，其中以术后1，3 d损伤较为严重。与上述2组相比，ADSC-CM组和ADSCs组各时间点的肝细胞排列较规则，基本呈索状，且炎症浸润和肝细胞坏死明显减少。

图1 肝脏组织病理学变化(200×) A,B,C,D.分别为模型组术前、术后1，3，7 d的HE结果；E,F,G,H.分别为DMEM组术前、术后1，3，7 d的HE结果；I,J,K,L.分别为ADSCs组术前、术后1，3，7 d的HE结果；M,N,O,P.分别为ADSCs-CM组术前、术后1，3，7 d的HE结果

2.2 肝脏ERS信号分子的mRNA表达水平

2.2.1GRP78 由表2知，GRP78基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的GRP78基因在术后1,3 d的mRNA表达水平均极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，而与DMEM组在上述时间点均无显著性差异；ADSC-CM组的GRP78基因在术后1,3 d的mRNA表达水平均极显著低于DMEM组(P<0.01)，而与ADSCs组在上述时间点均无显著性差异。

2.2.2ATF6 由表3可知，ATF6基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的ATF6基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，在术后3 d显著高于ADSCs组(P<0.05)，而与DMEM组无显著性差异；ADSC-CM组的ATF6基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著低DMEM组(P<0.01)，在术后3 d显著低于DMEM组(P<0.05)，而与ADSCs组在上述时间点均无显著性差异。

表2 GRP78基因mRNA表达变化

表3 ATF6基因mRNA表达变化

2.2.3IRE1 由表4可知，IRE1基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的IRE1基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，而与DMEM组无显著性差异；ADSC-CM组的IRE1基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著低DMEM组(P<0.01)，而与ADSCs组无显著性差异。

表4 IRE1基因mRNA表达变化

2.2.4PERK 由表5可知， PERK基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的PERK基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，在术后3 d显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.05)，而与DMEM组在上述时间点无显著性差异；ADSC-CM组的PERK基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著低DMEM组(P<0.01)，而与ADSCs组无显著性差异。

表5 PERK基因mRNA表达变化

2.2.5ATF4 由表6可知，ATF4基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的ATF4基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，在术后3 d显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.05)，而与DMEM组在上述时间点无显著性差异；ADSC-CM组的ATF4基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著低DMEM组(P<0.01)，在术后3 d显著低DMEM组(P<0.05)，而与ADSCs组无显著性差异。

表6 ATF4基因mRNA表达变化

2.2.6CHOP 由表7可知，CHOP基因在模型组、DMEM组、ADSC-CM组和ADSCs组中的mRNA表达水平在时间上均呈现先升高后降低的趋势，且均于术后1 d达到峰值，相比于术前差异极显著(P<0.01)。模型组的CHOP基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著高于ADSC-CM组和ADSCs组(P<0.01)，而与DMEM组无显著性差异；ADSC-CM组的CHOP基因在术后1 d的mRNA表达水平极显著低DMEM组(P<0.01)，而与ADSCs组无显著性差异。

表7 CHOP基因mRNA表达变化

3 讨论

脂肪间充质干细胞作为一种具有自我更新以及多向分化潜能的干细胞，在再生医学中获得广泛应用。然而近年来的研究发现，干细胞移植入机体后存活时间短，但其会分泌多种细胞外囊泡和可溶性因子，以此调节作用位点的局部微环境，促进组织的修复再生[12-13]。来源于脂肪间充质干细胞的ADSC-CM，不仅有抑制凋亡、诱导血管再生和促进细胞增殖的作用，而且相对于干细胞来说没有排斥反应和致瘤性的风险[9,14]。FOURASCNEV等[15]通过阻断左侧叶和中叶60 min，缺血结束后结扎并切除右侧正中叶、右侧外侧叶和尾状叶建立大鼠缺血再灌注合并半肝切除模型，术后给予人肝脏来源的间充质干细胞条件培养液(MSC-CM)，结果发现血清和组织样本中治疗组ALT和AST水平显著低于对照组，表明MSC-CM能有效减少肝脏组织的损伤，促进肝脏组织的再生。MASOUMEH等[16]通过闭塞大脑中动脉(MCAO)建立大鼠局灶性脑缺血模型，并给予人羊膜来源间充质干细胞条件培养液治疗，发现治疗组的梗塞体积、脑水肿和伊文思蓝渗透率显著低于对照组，改善了脑缺血急性期的病理效应。大量研究表明间充质干细胞条件培养液可在多种疾病中发挥作用[17]，而ADSC-CM更加容易获得和制备的特性备受人们关注。为探究ADSC-CM对肝脏I/R以及手术切除损伤的保护作用，本试验建立了小型猪肝脏I/R合并肝脏部分切除模型，并于切除后肝脏局部注射ADSC-CM干预治疗。对术前及术后1，3和7 d的肝脏组织进行HE染色观察。组织学结果显示，ADSC-CM干预后肝脏结构得以改善，肝细胞坏死、炎症细胞浸润和空泡变性减少，证明ADSC-CM可以有效减轻肝I/R和切除后的肝组织损伤。

肝脏手术中的I/R过程会加剧组织的损伤，目前对于肝脏I/R方面进行了大量的研究。一般认为能量代谢紊乱是造成IRI的主要原因，随后活性氧(ROS)、促炎细胞因子以及钙超载的产生加重了I/R损伤的发生，而这些损伤因子均可诱导内质网的功能障碍，引发ERS并促进ERS介导的凋亡反应[18-19]，这说明ERS在I/R导致的组织损伤中发挥重要作用。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是一种伴侣热休克蛋白,其存在于真核生物内质网上，参与蛋白质的装配、折叠、转运和细胞内钙稳态的维持等多个生理过程[20]。因此GRP78被认为是内质网稳态的标志物，其表达量的上升表明ERS的发生[20-21]。石印青等[21]研究发现，在大鼠肝脏70%缺血模型中，I/R损伤与GRP78的表达量呈正相关趋势。LI等[22]研究发现，在小型猪肝脏I/R合并部分肝切除模型中，GRP78于再灌注即刻和1 d的表达量显著高于假手术组，并且内质网相关通路信号分子表达量与GRP78趋势一致。以上结果表明I/R损伤能诱导ERS的发生，并可以通过检测其标志物GRP78表达量判断ERS发生与否和轻重程度。在本试验中，各组术后1，3 d 的GRP78 mRNA表达水平显著均高于术前，证明该模型中发生了ERS，与其他人的研究结果基本一致。CHI等[23]研究发现，ADSCs可以通过调节UPR反应显著降低GRP78标志蛋白的表达，以此改善改善MCAO大鼠的神经功能症状。本研究结果同样发现，在术后1,3 d时ADSC-CM组和ADSCs组的GRP78表达水平显著均低于模型组，而两者间无显著性差异，这说明ADSC-CM能显著抑制术后的GRP78 mRNA的表达和ERS，减轻手术中的I/R损伤。

ERS也被称为未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)，UPR是一种细胞为适应体内微环境的改变而出现的自我保护机制[24]。在适应期UPR发挥保护作用有三方面：上调GRP78等伴侣蛋白的表达，促进未折叠蛋白的折叠；下调伴侣蛋白外其余蛋白的合成，减轻内质网负荷；促进内质网对未折叠或错误折叠蛋白的降解[25]。在哺乳动物中，UPR以上过程主要依靠ATF6、IRE1以及PERK 这3条信号通路进行调节，三者也在一定水平上反映了ERS的强弱程度[4]。CHI等[23]的研究结果表明，MCAO大鼠 ATF6、XBP-1以及eIF-2α表达量均显著高于对照组，而三者在ADSCs治疗组的表达量极显著低于MCAO组。本试验也对ERS的3条信号通路做了进一步探究。结果显示，在建立模型1 d后，各组的ATF6、IRE1以及PERK这3个信号通路起始分子的mRNA表达量均高于术前，这说明3条信号通路均参与了在此模型所致的ERS的调节。而且ADSC-CM组和ADSCs组的三者表达水平显著均低于模型组和DMEM对照组，这说明ADSC-CM能显著下调I/R损伤所致的ERS 3条信号转导通路的表达；说明ADSC-CM可以通过抑制过度的ERS，减轻机体损伤。

如果ERS过于强烈或者持续存在时，UPR生存信号将会启动凋亡信号，会激活3条信号通路下游相关凋亡通路诱导细胞发生凋亡。越来越多的证据表明ERS诱导的细胞功能障碍和细胞死亡是许多疾病发生的主要原因[21,26]。ERS诱导的下游凋亡途径主要有Caspase-12激活通路、CHOP激活通路和JNK激活通路。值得注意的是Caspase-12只存在于鼠上，而在猪中目前尚未发现Caspase-12或者同功能的Caspase家族其他成员[27]。同时相关研究表明[28]，在缺血性肝ERS中，ATF4-CHOP通路是肝细胞主要的凋亡途径。持续过度的ERS会诱导许多凋亡相关蛋白的表达，其中以ATF4等为代表的众多蛋白均能促使诱导细胞凋亡的CHOP过表达，而CHOP的表达会加剧细胞的氧化应激水平，促进I/R损伤和细胞凋亡[22]。本试验结果显示，该肝损伤模型能显著上调ATF4和CHOP的mRNA表达水平，而ADSC-CM和ADSCs治疗组的ATF4和CHOP的mRNA表达水平显著低于模型组和DMEM对照组，说明ADSC-CM和ADSCs治疗可以抑制ERS诱导的凋亡反应，保护肝细胞，这与肝脏组织病理结果相一致。胡捷等[29]也证实了人脐带间充质细胞来源的条件培养液可以抑制衣霉素导致的大鼠视网膜神经节细胞的ERS，并显著降低CHOP的mRNA和蛋白表达水平，减少细胞凋亡的发生。

本试验的研究结果表明，在小型猪肝脏I/R合并肝脏部分切除损伤模型中，I/R和肝切除等损伤能够诱导肝细胞发生过度的ERS，而ADSC-CM干预可减少过量的ERS并抑制ERS诱导的肝细胞凋亡，从而减轻肝脏手术过程中的I/R和外科损伤。