内蒙古额济纳旗亚洲璃眼蜱的鉴定及其基因多态性分析

王云冲,黄天鹏,格日勒图

(内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

内蒙古位于我国北部边陲，拥有中国最大的天然草场，属于中国最重要的畜牧产业基地。草原上的野生动物和自然放牧的家畜均为蜱虫侵袭的主要对象，这样的环境为蜱虫的孳生提供了必要的条件。据1984年统计内蒙古的硬蜱有16种[1]，2008年陈泽等[2]报道内蒙古共有硬蜱15种。在2014年王建军等[3]经过标本检测和文献检索统计发现，内蒙古蜱类共有硬蜱21种，其中硬蜱科硬蜱亚科硬蜱属4种(草原硬蜱、全沟硬蜱、长蝠硬蜱和嗜鸟硬蜱)、血蜱亚科血蜱属5种(草原血蜱、日本血蜱、长角血蜱、铃头血蜱和嗜群血蜱)、扇头蜱亚科璃眼蜱属5种(亚洲璃眼蜱、残缘璃眼蜱、盾糙璃眼蜱、亚东璃眼蜱和麻点璃眼蜱)，革蜱属5种(银盾革蜱、边缘革蜱、草原革蜱、森林革蜱和中华革蜱)，扇头属2种(短小扇头蜱和血红扇头蜱)。额济纳隶属于内蒙古自治区阿拉善盟，地处中国北疆，位于内蒙古自治区最西端，西南与甘肃省交界，北与蒙古国接壤[4]。气候呈干旱少雨，蒸发量大，日照充足，温差较大，风沙多等特点。骆驼、黄羊和野驴等是该地区主要的动物种类。这种半荒漠和荒漠环境条件，为亚洲璃眼蜱的生活和繁殖提供了有利的条件，内蒙古地区存在的璃眼蜱属都分布在阿拉善地区，其中亚洲璃眼蜱属于内蒙古额济纳地区的优势蜱种[5]。

亚洲璃眼蜱(Hyalommaasiaticum)属于节肢动物门(Arthropoda)，蛛形纲(Arachnida)，蜱螨目(Acaridae)，硬蜱科(Ixodidae)。璃眼蜱属(Hyalomma)主要分布在荒漠和半荒漠地区，能够在灌木丛和胡杨林环境中生存，主要寄生宿主为双驼峰、牛、马、羊和野猪等动物，也能侵袭人[6-7]。亚洲璃眼蜱也是多种自然疫源性疾病的传播媒介，主要包括新疆出血热(Crimean hemorrhagic fever)、环形泰勒虫病(Theileriaannulata)和Q热病(Q fever)等[8-10]，对我国畜牧业的发展及人类的健康带来很大的威胁。随着分子生物学技术的飞速发展，很多现已应用到蜱虫的种型鉴定及其多态性研究等多个领域中[11]。在基因水平上对蜱虫种型进行鉴定，最常用的基因是16S rRNA基因、COⅠ基因以及ITS2基因等[12]。该技术可得到准确的遗传信息，为了解蜱虫的起源、类群间的进化和演化关系等提供基础信息。本研究运用传统形态学和分子生物学相结合的方法对该地区蜱种进行鉴定，并通过生物信息学软件对不同采样点蜱虫的基因多态性进行分析，为后期开展地方性蜱种研究与蜱传疾病的防制工作提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂琼脂糖、溴化乙锭，均购自Sigma公司；质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒，均购自AxyGEN公司；pMD19-T载体、Premix Taq，均购自TaKaRa公司。

1.2 仪器解剖显微镜，购自日本OLYMPUS公司；紫外凝胶成像系统，购自法国Vilber公司；电热恒温水浴锅，购自上海一恒科学仪器有限公司；电子天平，购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；水平电泳槽，购自美国BIO-RAD有限公司；恒温振荡培养箱，购自江苏太仓试验设备厂；多功能酶标仪和PCR仪，购自基因有限公司。

1.3 蜱虫2017年5月，从内蒙古阿拉善额济纳旗与蒙古国接壤附近区域选取3个采样点，分别为黑城(125只)、七号山(141只)和居延海(117只)。用常规方法在骆驼(未药浴)的体表共采集383只寄生硬蜱，并置于70%乙醇中保存备用。

1.4 硬蜱形态学鉴定用解剖显微镜(OLYMPUS SZ51)进行镜下观察，根据硬蜱的形态学特征进行初步鉴定，主要观察假头基、须肢、盾板、生殖孔、足转节、肛沟和气门板等形态特征[13]，从而确定蜱种。

1.5 核酸提取将硬蜱先用酒精浸泡灭杀体表寄生病原，再用PBS冲洗3次[14]。液氮速冻后，用无菌研磨棒在1.5 mL离心管中研碎，加入已65℃预热的2% CTAB抽提缓冲液，按照CTAB方法提取硬蜱核酸[15]。

1.6 引物设计及合成参考GenBank不同硬蜱的16S rRNA，应用Primer 5.0设计硬蜱16S rRNA 的扩增引物；参考文献中扩增蜱虫COⅠ基因的引物，引物序列如表1所示。该引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

表1 引物序列及目的片段长度

1.7 基因扩增及测序以提取的蜱虫DNA为模板，经PF1和PR1与PF2和PR2两对引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μL：DNA模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Premix Taq 10 μL，灭菌去离子水 6 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，46℃(16S rRNA基因)和55℃(COⅠ基因)退火40 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃总延伸10 min。PCR扩增结束后，1%琼脂糖凝胶电泳，再按照AxyGEN DNA凝胶回收试剂盒说明书回收目的片段。胶回收产物与pMD19-T载体连接，连接体系为10 μL：目的片段4 μL，pMD19-T载体1 μL，SolutionⅠ 5 μL，4℃连接过夜。连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并在含氨苄青霉素的普通LB固体培养基上进行阳性克隆筛选。挑取可疑菌落，接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，使用质粒小量提取试剂盒提取重组质粒，对其进行PCR和双酶切鉴定，各取5 μL PCR产物和酶切产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。将阳性质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.8 系统发育进化树的构建利用Mega 7.0[16]生物学软件中最大似然法(maximum likelihood method)构建系统发育树。分析模型为Kimura2-parameter，进行1 000次自主复制(bootstrap replication)，以确定模型的稳定性，最终获得系统发育进化树。

1.9 蜱虫16S rRNA基因多态性的分析从黑城、七号山和居延海3个采样地点，分别随机选择10个样本进行蜱虫16S rRNA基因测序，应用Genetyx-Version 6软件对30个测序序列进行同源比对，并分析其16S rRNA基因的多态性。

2 结果

2.1 传统形态学鉴定结果如图1所示，经传统形态学鉴定采自内蒙古阿拉善额济纳旗的383只蜱虫均符合亚洲璃眼蜱的形态特征：躯体呈卵圆形；假头长，假头基侧缘略凸出；颈沟深而长，相当明显；背突细窄；基节Ⅰ外距窄长，基节Ⅱ～Ⅳ外距粗短，按节序渐小；爪垫短小，不及爪长之半，各关节处有明亮淡黄色环带，在背缘也有同样淡色的纵带。雌虫，假头基后缘近于直；基突付缺，盾板椭圆多角形，长胜于宽，后缘尖窄，略呈角状；气门板逗点形，足粗细适中。雄虫，假头基后缘呈角状内凹，基突粗大而钝；盾板卵圆形，前部渐窄，后缘钝圆；气门板曲颈瓶形，足按足序渐粗。

图1 亚洲璃眼蜱形态学鉴定 A.雄性蜱虫；B.雌性蜱虫；A1、B1.背面;A2、B2.假头基;A3、B3.缘垛;A4、B4.腹面;A5、B5.生殖孔;A6、B6.肛沟

2.2 亚洲璃眼蜱16S rRNA基因序列系统发育进化树分析结果如图2所示，从GenBank中选取代表性蜱虫的16S rRNA基因序列19个，运用Mega 7.0软件绘制系统发育进化树，阿拉善额济纳旗采集的蜱虫样本与新疆的亚洲璃眼蜱在同一个分支上并能够产生很好的聚类。

图2 基于16S rRNA基因序列ML法构建系统发育进化树

2.3 亚洲璃眼蜱COⅠ基因序列系统发育进化树分析结果如图3所示，从GenBank中选取代表性蜱虫的COⅠ基因序列18个，运用Mega 7.0软件绘制系统发育进化树，阿拉善额济纳旗采集的蜱虫样本与新疆的亚洲璃眼蜱在同一的分支上能够产生很好的聚类。

图3 基于COⅠ基因序列ML法构建系统发育进化树

2.4 亚洲璃眼蜱16S rRNA基因多态性分析应用Genetyx-Version 6软件对30个样品的16S rRNA基因序列进行同源性比对分析，如图4所示，A6序列与其他29个样品存在基因多态性的变化，包括5处A↔T碱基点突变，1处G↔T碱基点突变，1处A↔G碱基点突变。B8序列与其他序列也存在1处G↔A碱基点突变。B9序列与其他序列也存在1处C↔T碱基点突变。

图4 亚洲璃眼蜱16S rRNA的基因多态性 A1～A10.黑城地区亚洲璃眼蜱16S rRNA基因序列;B1～B10.七号山地区亚洲璃眼蜱16S rRNA基因序列;C1～C10.居延海地区亚洲璃眼蜱16S rRNA基因序列

3 讨论

亚洲璃眼蜱可以通过直接叮咬的方式对宿主的皮肤造成危害，导致宿主皮肤发生充血和水肿等病理变化，使动物产生疼痛、过敏性皮炎和伤口蛆病等症状。更为重要的是，亚洲璃眼蜱也是多种病原微生物的重要传播媒介[17-18]，给内蒙古阿拉善地区畜牧产业的发展带来了巨大的威胁。另外，国内外对亚洲璃眼蜱的基因多态性的研究鲜有报道。因此本研究为阿拉善地区亚洲璃眼蜱的鉴定以及在遗传进化过程中产生的基因多态性的研究奠定基础。

目前蜱虫的鉴定不仅可以依靠传统形态学的鉴定方法，随着近几年分子生物学的飞速发展，分子生物学手段也成功地被应用到了蜱虫的鉴定中。在本研究中我们借助解剖镜观察，并参考《中国经济昆虫志》对于蜱虫形态学的描述[19-20]，发现采集的蜱虫在外观形态、假头基、肛后板及足等特殊结构均符合亚洲璃眼蜱的形态特征，但雌性蜱虫饱血后发生了部分的形变，如雌性蜱虫的生殖孔变小。但运用传统形态学方法对蜱虫鉴定还需要有经验的专家才能够进行确认，对于一般科研工作者和检疫人员，想熟练掌握蜱虫传统形态学鉴定方法是相对困难的，因此我们又采用了分子生物学的方法进行蜱虫的种型鉴定。结果显示无论是蜱虫的16S rRNA基因序列还是COⅠ基因序列，都能够与NCBI中已知的亚洲璃眼蜱达到99%以上的同源性。从16S rRNA基因和COⅠ基因的系统发育进化树结果中可以确认，我们采集的蜱虫与来自新疆地区的亚洲璃眼蜱在同一个进化分支上，并能够很好的形成聚类，表明所采集的蜱虫与来自新疆地区的亚洲璃眼蜱可能来自于同一祖先蜱，这一结果与传统形态学的鉴定结果相吻合，证明我们采集的蜱虫为亚洲璃眼蜱，这为内蒙古地区蜱虫的分布调查补充了有利的数据。

通过Genetyx-Version 6软件对3个不同采集的地区的亚洲璃眼蜱进行多态性分析，在亚洲璃眼蜱16S rRNA的基因多态性结果中，发现除A6、B8和B9序列外，其他27个样品均不存在基因多态性，表明该该地区亚洲璃眼蜱存在比较缓慢的进化速率。而A6序列与其他29个序列存在基因多态性的变化，包括5处A↔T碱基点突变，1处G↔T碱基点突变，1处A↔G碱基点突变。B8序列与其他序列也存在1处G↔A碱基点突变。B9序列与其他序列也存在1处C↔T碱基点突变。可见基因多态性的变化是存在的，不同的地域环境给蜱虫的进化带来了影响，蜱虫为了更好地适应环境的变化而产生了基因多态性的变化。但本研究也存在不足的地方，样品分析的统计数量不足，很难对蜱虫基因多态性的变化进行证实，但在如此少的样品中就存在基因多态性的变化，说明基因多态性的变化肯定是存在的，这些数据为蜱虫种群分析及蜱传疾病的探索等研究工作奠定了基础。