池塘养殖水体与底泥中恩诺沙星降解规律的初步研究

李邦平 ，孟勇 ，，朱晓华 ，，陈鑫 ，沈美芳 ，，边文冀

（1.江苏省淡水水产研究，江苏 南京 210017；2.江苏省水产质量检测中心，农业农村部渔业产品质量监督检验测试中心，江苏 南京 210017）

恩诺沙星为第三代喹诺酮类抗菌药物，又名乙基环丙沙星，具有广谱抗菌活性、具有很强的渗透性，广泛应用于畜禽和水产养殖领域。能与细菌DNA回旋酶亚基A结合，从而抑制了酶的切割与连接功能，阻止了细菌DNA的复制，呈现出一定的抗菌作用[1]。近几年来，这类药物在水产养殖业中常被作为渔药和饲料添加剂，用来预防和治疗水产动物全身性细菌感染等疾病[2]。但恩诺沙星会导致其在水产品的残留、耐药性的增强、在养殖环境中的残留问题以及通过食物链影响到人类健康等方面广泛引起重视[3]。

目前，国内外主要集中于恩诺沙星在鲤鱼、欧洲鳗鲡、吉富罗非鱼、鳗鱼等鱼体内的药物代谢规律的研究[4-7]，但关于恩诺沙星在渔业养殖环境中降解规律缺少相关实验依据，为了更加贴切实际生产情况，走访了大量鮰鱼养殖户，参考实际给药方式和给药浓度，笔者研究了池塘养殖条件下恩诺沙星及其代谢产物在斑点叉尾体内的残留消除规律[8]；同时，针对水产养殖环境中对使用过恩诺沙星类药物的养殖环境进行跟踪检测。该文旨在探讨在养殖环境（底泥和水体）中恩诺沙星和环丙沙星降解规律的初步研究，为水产品的安全性研究与风险评估提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品

试验用恩诺沙星、环丙沙星及其氘代物(氘代恩诺沙星和氘代环丙沙星)内标标准品（纯度≥99.0%，Dr.Ehrenstorfer）；恩诺沙星原粉（纯度≥99.0%，浙江某药业进出口有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；乙酸铵、甲酸（色谱纯，美国ROE公司）；该实验用水均来自Millipore纯水系统。

1.2 主要仪器

高效液相串联质谱仪（Qtrap 4500，美国SCIEX公司）；匀浆机（T18，德国IKA公司）；高速冷冻离心机（AllegraTM，美国BECKMAN公司）；浓缩工作站（Turbo Vap瑞典Biotage公司）。

1.3 试验设计与样品采集

1.4 样品前处理

量取经0.45 μm玻璃纤维滤膜过滤的水样500 mL，加入 50 μL 的内标混合液（Enrofloxacin-d5和Ciprofloxacin-d8）以及0.4 g EDTA，在4℃保存。提取之前，再用甲酸调节pH值2.0～3.0。然后依次用6 mL甲醇、6 mL去离子水、6 mL磷酸盐缓冲液（pH=3.0）对HLB固相萃取柱淋洗活化。控制流速3 mL/min左右，将水样上柱。待过柱完成后，用6 mL去离子水冲洗HLB柱，抽真空5 min，以去除柱中残留的水分。最后以6 mL甲醇洗脱1次，收集洗脱液，并在室温下用 N2吹干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）混合液定容 1 mL，涡旋震荡 3～5 min，过 0.22 μm 滤膜，待测。

将采自养殖池塘表层（0～10 cm）的底泥，剔除其中石块以及植物残体，将底泥置于-40℃冷冻干燥一周。研磨干燥过后的土样，过250 μm孔径尼龙筛，置于-40℃存放。称取10 g经研磨过后的土样于50 mL离心管中，加入50 μL的内标混合液和0.4 g EDTA，以及混合提取液20 mL（磷酸盐缓冲液（pH=3.0）-乙腈，1∶1，V/V），涡旋 5 min，4 ℃下 5 000 r/min离心15 min，收集上层提取液。反复提取1次，合并提取液并混匀。在室温下用N2吹至总体积小于20 mL，用去离子水稀释到100 mL，用甲酸调节pH值2.8～3.0。用SAX-HLB串联固相萃取柱净化与富集，过柱完成后，除去SAX柱，用6 mL去离子水冲洗HLB柱，抽真空5 min，以去除柱中残留的水分。最后以6 mL甲醇洗脱1次，收集洗脱液，并在室温下用 N2吹干，用乙腈-0.1%甲酸（2∶8，V/V）混合液定容 1 mL，涡旋震荡 3～5 min，过 0.22 μm 滤膜，待测。

1.5 试验分析与结果处理

色谱条件和质谱条件见孟勇等[8]方法，数据处理利用内标法（氘代恩诺沙星和氘代环丙沙星为内标物）计算含量，采用SigmaPlot 11.0软件处理进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 方法验证结果

根据图1显示结果，恩诺沙星和环丙沙星在质控样品和底泥中的残留有较好的检出峰形,空白对照组未出现检出峰，且内标物氘代恩诺沙星和氘代环丙沙星峰形良好。检测限浓度为1 ng/mL，依据内标法进行定量，利用SAX-HLB串联固相萃取柱达到净化与富集的效果，可以很好避免水体和底泥中非目标化合物的干扰，检测浓度准确可靠，可以很好避免检测过程中出现过多的目标物损失，以致试验失败。

在加标水平1.0～10.0 μg/kg时，所得到的恩诺沙星和环丙沙星的平均回收率均大于80%，精密度小于10%。在空白样品中添加恩诺沙星和环丙沙星，信噪比（S/N）为3时计算检测限（LOD），信噪比（S/N）为10时计算定量限（LOQ）。结果表明该方法能够满足检测残留分析的要求，具体结果见表1。

表1 不同环境样品的回收率

2.2 池塘水体中恩诺沙星的降解分析

图2显示恩诺沙星在养殖水体中的残留情况。结果表明，在连续投喂5 d拌有恩诺沙星的饲料后，养殖水体中恩诺沙星在第5天出现峰值分别为：在高剂量投喂水平下是738.9 ng/L，在低剂量投喂水平下是621.7 ng/L，在喂药结束后开始下降，持续到第29天，29 d后高剂量组达到最低值16.2 ng/L，低剂量组9.3 ng/L。第29天后水体中恩诺沙星含量达到平衡。而水体中未检测到环丙沙星的变化。

2.3 池塘底泥中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星的降解分析

图3显示恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在养殖底泥中的残留情况。结果显示，恩诺沙星在第7天出现峰值，在高剂量投喂水平下是228.5 ng/g，在低剂量投喂水平下是135.6 ng/g；第11天开始下降，持续到第29天，29 d后高剂量组达到最低值18.6 ng/g，低剂量组7.3 ng/g；其代谢产物环丙沙星出现峰值也是在第7天，高剂量投喂水平下是23.3ng/g，低剂量投喂水平下是9.0 ng/g，第11天开始下降，持续到第29天，29 d后高剂量组达到最低值4.4 ng/g，低剂量组2.9 ng/L。第29天开始底泥中恩诺沙星和环丙沙星含量达到平衡。

3 讨论

3.1 池塘水体中恩诺沙星的消除规律分析

连续5 d投喂带有恩诺沙星的饲料后，水体中恩诺沙星在第5天出现峰值，第7天开始下降，持续到第29天。第29天后水体中恩诺沙星含量达到平衡。有报道称，池塘养殖模式下投喂的饲料有5%～10%的未被鱼类食用，而被食用消化的饲料中又会有25%～30%的以粪便形式排出体外，剩饵、粪便的累积都会导致水体里药物残留。未被鱼类食用，以及残渣、粪便都会使水体里恩诺沙星的含量增高[9,10]。相关报道称，恩诺沙星进入水体后，会被坏境沉积物所吸附，较长时间不被分解反复经过解析作用从而导致其长时间不被消除[11-12]。连续5 d的给药时间，在第5天出现峰值，第7天开始消耗累积的药物，持续到第29天，之后较长一段时间表现出的是环境的动态平衡。杨秋红等[13]在研究斑点叉尾在不同温度下对恩诺沙星代谢规律发现，在120 d后肌肉中恩诺沙星含量是0.012 mg/kg和0.001 mg/kg。孟勇等[8]在池塘养殖条件下恩诺沙星及其代谢产物在斑点叉尾体内的残留消除规律中提到，两种剂量投喂模式下，在138 d后肌肉中恩诺沙星含量是0.013 mg/kg和0.019 mg/kg。李娜[14]在恩诺沙星在养殖大菱鲆体内的残留及消除规律的研究中发现，94 d后肌肉组织中恩诺沙星的含量为0.168 mg/kg。对比发现恩诺沙星的残留在水产品组织内很难被清除，这很可能与水体中残留有关。恩诺沙星在不同生物体内代谢产物种类及含量存在差异，吴宝银[15]关于恩诺沙星水解特性的研究发现，恩诺沙星在水体中不能被代谢为环丙沙星。Tiefenbacher[16]研究表明，环丙沙星光解时会产生一种二聚合物。Hudrea[17]进一步阐明了环丙沙星的光解产物为乙二胺基化合物。对比该试验结果，恩诺沙星在进入水体后，未检测到环丙沙星的变化，可能与其光解有关。而恩诺沙星在水体中存在时间较长，药物剂量和残留量存在一定的相关关系，剂量越大会加大残留量。

3.2 池塘底泥中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星消除规律分析

连续5 d投喂带有恩诺沙星的饲料后，底泥中检测出环丙沙星的存在，在第7天出现峰值，第11天开始下降，持续到第29天。第29天后底泥中恩诺沙星和环丙沙星含量达到平衡。底泥中恩诺沙星出现峰值比水体中要晚，可能与鱼类排泄以及底泥的吸附有关。刘永开在关于恩诺沙星在水产中的应用和研究中，报道了当恩诺沙星进入水体后，会被水环境中的沉积物所吸附，且水体里消失恩诺沙星有约65%的进入淤泥。所以进入淤泥的恩诺沙星保持较长时间不被分解，反复经过解析作用向水体中释放[18]。王富民等[12]报道了恩诺沙星和环丙沙星在湖库底泥和土壤中的吸附与解析特性的研究，水体中N、P含量的变化，对底泥和土壤对CIP和ENR的吸附/解吸过程有不同影响。吴银宝[11]在对土壤对恩诺沙星的吸附和解吸特性研究中发现，土壤对恩诺沙星的吸附性很强，吸附量占水相中恩诺沙星总量的99%以上，其解析量仅为吸附量的1‰左右。这很有可能解释土壤对恩诺沙星和环丙沙星的吸附导致其出现峰值时间要比水体中出现峰值要晚的原因。对比水体中恩诺沙星消除规律发现，养殖环境维持在29 d以上，水体中和底泥中恩诺沙星的残留量达到环境平衡时，其含量维持在较小范围的浮动变化，说明恩诺沙星在底泥和水体中存在一定的反复吸附和解析的过程，且呈现平衡状态。张春艳等[19]研究发现，底泥对恩诺沙星的吸附性很强，且环丙沙星在底泥中的降解相当缓慢，结果与该文相一致。

3.3 养殖环境中恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星对生态风险的评估

环境中药物残留消除规律的研究对水产品质量安全有重要的参考价值。董玉瑛[20]在对水体中盐酸环丙沙星的风险等级分析中提出，在沿海养殖区的环境风险甚至高于污水处理厂排水。吴宝银在对恩诺沙星在鸡粪中的残留及其生态毒理学研究中指出，恩诺沙星不仅会在畜禽产品中残留，其活性代谢物还会随着排泄物进入生态，对生态造成影响。杨弯弯等[21]在研究恩诺沙星对铜绿微囊藻的毒性研究中，发现恩诺沙星能够阻碍铜绿微囊藻的光合作用，抑制其可溶性蛋白的合成。马驿[22]的研究发现环丙沙星对土壤微生物量碳含量影响显著（P＜0.05），土壤中环丙沙星浓度愈高，微生物量碳含量愈低，100 μg/g的环丙沙星处理使土壤微生物量碳含量下降58.69%。环丙沙星对土壤微生物群落碳代谢功能影响显著，环丙沙星降低了土壤微生物对碳水化合物、羧酸、氨基酸、聚合物、酚类和胺类的碳源利用率。关注养殖环境中恩诺沙星和环丙沙星的残留量，是水产养殖关键之所在。要想养好鱼，就要有好的水质和底泥环境。美国FDA组织对恩诺沙星类药物做了强烈性限制，规定鱼、贝类水产品中对恩诺沙星和环丙沙星不得有检出[23]。因此，在养殖出口鱼类、贝类养殖过程中要注意养殖环境的选择。在该试验的重点研究了养殖水体和底泥中恩诺沙星环境中的代谢及残留分析。试验结果也证实了，在关注产品的同时，也不可忽视对水产品养殖环境的改善，解决措施定期清底曝晒和换水，改善养殖环境。