化瘀通络灸对VD大鼠体外干预HUVEC-12细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响

张曼 陆定其 吴伟伟 杨骏

[摘要] 目的 觀察化瘀通络灸对VD大鼠血清体外干预HUVEC-12细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响。 方法 采用四血管阻断法制造VD大鼠模型，随机分为艾灸组、模型组、西药组，另设假模型组作为对照，艾灸组采用化瘀通络灸法，取百会、神庭、大椎艾灸，西药组茴拉西坦灌胃，每日一次，治疗2个疗程，采用跳台实验检测各组神经行为学评分。取艾灸组、模型组、假模型组VD大鼠的血清体外培养HUVEC-12细胞，另设平行培养液组作为对照，采用Western blot法检测各组VEGF、bFGF的蛋白表达。 结果 治疗结束后，与模型组潜伏期为（36.25±10.71）s、错误次数为（6.19±0.74）次、神经行为学评分为（3.00±0.53）分比较，艾灸组和西药组的潜伏期为（232.31±22.25）s和（201.38±13.12）s，均延长（P<0.01）;错误次数为（1.00±0.56）次和（2.53±0.84）次及神经行为学评分为（1.00±0.56）分和（1.74±0.47）分，均降低（P<0.01）。艾灸组和西药组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组、假模型组、平行液组比较，艾灸组的HUVEC-12细胞VEGF、bFGF的蛋白表达水平（0.84±0.09）和（0.87±0.05）较高，有显著差异（P<0.01）。 结论 化瘀通络灸法能够明显提高VD大鼠学习记忆能力，增强HUVEC-12的VEGF、bFGF的蛋白表达，其治疗VD可能与其促血管生成作用相关，为针灸治疗VD提供理论依据。

[关键词] 血管性痴呆;化瘀通络灸;血管生成;VEGF;bFGF

[中图分类号] R245          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）33-0033-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Huayu Tongluo Moxibustion on the expression of VEGF and bFGF protein in HUVEC-12 cells of VD rats in vitro. Methods The four-vessel blocking method was used to make VD rat models， and they were randomly divided into the moxibustion group， model group， and western medicine group. Another fake model group was set up as the control group. The moxibustion group was treated with moxibustion for removing blood stasis and dredging collateral， taking Baihui and Shenting， Dazhui for moxibustion. The western medicine group was given aniracetam lavage once a day for two courses of treatment. The platform jumping experiment was used to detect the neurobehavioral score of each group. HUVEC-12 cells were cultured in vitro from the serum of VD rats in the moxibustion group， the model group， and the sham model group， and the parallel solution group was also set up as the control group. Western blot was used to detect the protein expression of VEGF and bFGF in each group. Results After treatment， compared with the model group's incubation period was（36.25±10.71） seconds， the number of errors was（6.19±0.74）times， and neurobehavioral score was（3.00±0.53） points， the incubation period of the moxibustion group and the western medicine group was（232.31±22.25） seconds and（201.38±13.12） seconds were prolonged（P<0.01）; The number of errors was（1.00±0.56） times and（2.53±0.84） times and neurobehavioral scores was（1.00±0.56）points and（1.74±0.47）points were decreased（P<0.01）. The difference between the moxibustion and western medicine groups was statistically significant（P<0.05）. Compared with those of the model group， sham model group， and parallel solution group， the protein expression levels of VEGF and bFGF in HUVEC-12 cells in the moxibustion group（[0.84±0.09] and [0.87±0.05] ） were higher， with significant differences（P<0.01）. Conclusion Huayu Tongluo Moxibustion can significantly improve the learning and memory ability of VD rats， and enhance the protein expression of VEGF and bFGF of HUVEC-12. Its treatment of VD may be related to its pro-angiogenesis effect， which provides a theoretical basis for VD's acupuncture treatment.

[Key words] Vascular dementia; Huayu Tongluo Moxibustion; Angiogenesis; VEGF; bFGF

血管性痴呆（Vascular dementia，VD）多由脑血管疾病引起认知功能障碍[1]。随着我国人口老龄化的不断增加，VD的发病率随年龄逐渐增加，80～89岁为4.09%，90岁以上为6.10%[2]，是目前影响中老年人健康和生活质量的常见病、多发病。有学者研究发现其可能与大脑皮层、海马的病变有关[3]。近年来针灸治疗VD临床及实验研究均取得较好的进展[4-6]，尤其是“化瘀通络灸法”的运用。在脑缺血后的血管新生过程中，血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor， bFGF）发挥重要作用[7]。人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）作为血管内皮细胞研究较为稳定，可作为干预的观察对象。实验先行HUVEC细胞株的复苏和传代，然后经艾灸治疗的动物血清干预人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）培养。本研究观察化瘀通络灸对VD大鼠体外干预HUVEC-12细胞VEGF、bFGF蛋白表达的影响，探讨其治疗血管性痴呆可能的有效机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和药物

清艾条（Φ10 mm×100 mm，由安徽省天长市寿民灸具厂提供），茴拉西坦胶囊（0.1 g×30片/瓶，无锡市凯西药业有限公司，批号 20090112），TGL-20M高速台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司），DTT-2 大鼠跳台仪（由北京中国中医科学研究院提供），电化学发光（ECL）试剂盒（美国pierce公司），PRMI-1640培养液（GIBCO公司），EDTA（Hyclone公司），一抗兔抗人VEGF、一抗兔抗人bFGF、二抗羊抗兔IgG抗体（合肥泓杉生物科技有限公司）。

1.2 实验动物与分组

SPF级雄性Wistar大鼠60只，每只（250±50）g，由南京医科大学实验动物中心提供，SCXK（苏）2008-0004。假模型组8只由电脑随机数字法得出，其余大鼠复制血管性痴呆的模型，跳台实验筛选出合格痴呆大鼠24只，并随机分为艾灸组、西药组和模型组，每组8只。

1.3 造模[8]

四血管阻断法复制VD大鼠模型。假模型组保留双侧颈总动脉不予阻断。术后手术部位施以适量青霉素对抗感染，常规饲养。通过跳台实验筛选出符合条件的大鼠。将 2只大鼠放于2间内，适应3 min后通以40 V的交流电5 min。然后将其置于绝缘体平台后开始计时，第一次跳到铜栅上的时间作为潜伏期，5 min内跳下铜栅再跳回到平台的次数记录为错误次数，两者作为大鼠行为学记忆成绩。假模型组和已造模组大鼠在模型复制后4 d进行初次神经行为学评分，艾灸组和西药组于第二疗程治疗结束后6 h再次进行评分;模型组和假模型组平行进行神经行为学评分。按照改进的Longa[9]的5级评分标准，评分1～4分纳入实验。

1.4 方法

艾灸组采用化瘀通络灸法治疗，具体的操作方法是将大鼠固定于鼠板上，百会穴、神庭穴、大椎穴处剃毛参照实验动物穴位图点穴[10]。百会：顶骨正中;神庭：在额顶骨缝交界线前方;大椎：第7颈椎与第1胸椎之间。百会穴隔附子饼压灸，用附子粉、黄酒制成直径约15 mm、厚约5 mm附子饼，中间用针刺10个小孔。点燃清艾条在附子饼上压灸，皮肤灼热潮红时立即提起，旋即再压灸，共20 min，大椎穴和神庭穴悬起灸20 min。每天1次，15 d为1个疗程 ，共治疗2个疗程。西药组将茴拉西坦与蒸馏水混合成0.01 g/mL浓度的溶液灌胃，每千克大鼠茴拉西坦0.0625 g，疗程与艾灸组平行。模型组与假模型组鼠板固定后不做治疗，时间上与艾灸组相平行。

1.5 血清制备

艾灸组大鼠在每个疗程结束后，在目内眦取血2 mL，以3000 r/min离心15 min，然后同组的血清混合，56℃、30 min进行灭活，0.22 μm微孔滤膜进行过滤除菌，-20℃保存备用;模型组和假模型组制备血清的方法与艾灸组相同，西药组不制备。

1.6 HUVEC-12培养、分组及血清干预

1.6.1 复苏及传代培养  将HUVEC-12细胞株置于40℃温水中摇晃，移至离心管，加入含10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）及5%100 U/mL青霉素和链霉素的RPMI-1640的培养基中，稀释5倍，混匀，以1000 r/min离心5 min，弃上清液，加入完全培养液反复吹打混匀，5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养，出现80%融合状态时，以0.25%胰酶溶液消化传代。

1.6.2 种板  弃去细胞培养液，加入胰酶2 mL消化30 s～1 min后，弃去胰酶，加入全细胞培养液3 mL，吹打细胞使之脱落为单个细胞，进行细胞计数。按每孔105个细胞的密度接种于12孔培养板，继续培养细胞使其达到80%的密度。

1.6.3 分组及血清干预  实验HUVEC-12分为四组，艾灸组配制含10%艾灸组大鼠血清的RPMI-1640;模型组和假模型组分别配制含10%模型组与假模型组大鼠血清;平行培养液组配制含10%胎牛血清。取贴壁生长的单层细胞，换用无血清RPMI-1640培养液培养4 h。每组设6个复孔，更换不同的培养液，继续培养24 h。

1.7 Western blot法检测各组HUVEC-12细胞VEGF、bFGF蛋白的表达

PBS清洗细胞，加入RIPA细胞裂解液100 μL提取总蛋白，以BCA法检测上清液中蛋白浓度，按1∶1加入1×上样缓冲液。SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，加入Western封闭液，室温封闭2 h。加入一抗（VEGF、bFGF、Beta-actin抗体）4℃孵育过夜，清洗后加入HRP标记的二抗，室温孵育2 h，将漂洗过的滤膜在双蒸水中平衡5 min。取1 mL A、B液等比例混合底物，將发光剂和增强剂均匀的涂抹彻底覆盖薄膜，避光处理5 min弃去表面液体。最后采用X胶片显影。结果采用Quantity one 灰度分析软件分析图像。

1.8 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两样本均数比较采用t检验，方差不齐采用t'检验，多组均数间比较采用方差分析，其中两两比较采用SNK-q检验对数据进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 造模4 d VD大鼠神经行为学评分比较

见表1。造模组大鼠神经行为学评分均大于1，平均（2.45±0.76）分，表明造模成功。与假模型组比较，造模组大鼠的潜伏期、错误次数经t（t'）检验均有显著性差异（P<0.01，P<0.01），造模组大鼠的潜伏期显著短于假模型组，错误次数显著多于假模型组，表明VD模型大鼠的学习记忆成绩显著低下。

2.2 治疗后各组VD大鼠神经行为学评分比较

见表2。与模型组比较，艾灸组、西药组潜伏期较长，错误次数及神经行为学评分较低，差异有统计学意义（P<0.01）;与西药组比较，艾灸组潜伏期较长，错误次数及神经行为学评分较低，差异有统计学意义（P<0.05）。以上数据表明化瘀通络艾灸组和西药组均可以提高VD大鼠潜伏期，降低了VD大鼠错误次数及神经行为学评分，且艾灸组的疗效更显著。

2.3 Western blot法检测艾灸效应血清干预HUVEC-12的VEGF、bFGF蛋白表达水平

HUVEC-12细胞形态见封三图2。四组HUVEC-12细胞间VEGF、bFGF的蛋白表达的检测结果均有差异（P<0.01或P<0.05），见表3、图1。与模型组、假模型组、平行培养液组比较，艾灸组的HUVEC-12细胞VEGF、bFGF的蛋白表达具有显著性差异（P<0.01）。与假模型组比较，模型组VEGF、bFGF的蛋白表达有差异（P<0.05）。结合神经行为学评分，说明两个疗程治疗后，化瘀通络灸法组大鼠艾灸效应血清對HUVEC-12细胞VEGF、bFGF的蛋白表达水平较高，具有临床意义。

3 讨论

《灵枢经·海论》有“脑为髓之海……髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，懈怠安卧”。田金州等[11]认为，脑髓受损失养，风、火、痰、瘀诸邪内阻，致脑脉闭阻即发为VD。崔远武[12]认为在平台期和波动期以肝肾阴虚为本，痰瘀为实，表现为本虚标实。由此可见，VD病位在脑，其病性不外乎虚、痰、瘀、火，相互影响相互转化，其中瘀是关键病机。艾灸作为中医众多治疗手段中独具特色的一种治疗方法，中医针灸工作者在血管性痴呆的临床治疗中，发现艾灸对血管性痴呆的独特疗效[13-15]。百会穴位于督脉上，膀胱经通过此穴“入络脑”;神庭穴为督脉与足太阳膀胱经的交会穴，其深部为大脑顶叶、额叶所在，针灸此穴可“气至病所”从而改善额叶功能。大椎穴为“诸阳之会”，可通调头部气血。临床借助艾火的“温经通络”作用，附子饼的“温肾补阳，培补命门”作用，因此具“化瘀血，通脑络，填髓醒神”之功，称为“化瘀通络灸”。有大量试验研究发现[16-19]，化瘀通络灸法治疗能有效改善VD患者临床症状、神经行为学评分，但化瘀通络作用机制关键环节不详，可能存在的促血管生成机制还不清楚，是否通过启动了“血管生成”的扳机而引发脑内学习记忆要害部位的神经营养和神经元保护作用，其治疗作用可能与通过调控血管活性物质，调节RAGE和LRP-1的表达，改善大脑皮层额叶和海马CA1区神经元线粒体损伤等方面来实现的。实验前期课题组查阅了有关血管内皮细胞培养的文献资料，并调研了相关研究实验技术人员和专家，发现当前使用的人脐静脉内皮细胞株ECV304作为血管内皮细胞使用存在着一些不确定因素，如有报道该细胞株有分化为膀胱内皮的倾向，而人脐静脉内皮细胞株（HUVEC）较为稳定，因此最终选取了HUVEC 作为干预的观察对象。此次试验进一步分析血清干预对HUVEC-12表达VEGF、bFGF蛋白影响，获取化瘀通络灸法治疗VD的相关可能机制。

现代医学认为，VD发病机制可能与胆碱能通路损伤、兴奋性氨基酸受体发生激活并导致神经元细胞死亡、氧化应激损伤过程等有关[20]。有研究发现，血管生成和炎症标志物如VEGF、bFGF、MMP1和IL-8与VD的发生关联密切[21]。VEGF和bFGF能够协同作用促进成熟血管形成和有丝分裂，两者在缺血性脑损伤后水平急剧下降[22]，是参与VD病理过程的重要因子。VEGF是血管内皮细胞特异性促有丝分裂原，可影响内皮细胞和壁细胞调控血管生成和成熟。其中VEGF-A具有促进神经胶质细胞向神经元转化，与神经再生关系密切[23];bFGF作为另一种重要的血管生长因子，可促进神经性血小板衍生生长因子受体β的表达，促进轴突分支形成并刺激神经前体的增殖和分化[24]。本研究以HUVEC-12作为靶细胞，对VD大鼠血清干预细胞的VEGF、bFGF蛋白表达进行比较，并对VD大鼠的学习记忆成绩、神经行为学进行检测及评定，发现化瘀通络灸法组的效应血清能增强细胞株表达VEGF、bFGF血管活性蛋白，提高大鼠学习记忆成绩，揭示化瘀通络灸法治疗VD的效果及可能的作用机制，为针灸治疗该病的临床有效性提供理论依据。

[参考文献]

[1] 翁映虹，黄坚红. 血管性痴呆的定义及诊断进展[J].广东医学，2010，31（14）：1881-1882.

[2] Smith Eric E. Clinical presentations and epidemiology of vascular dementia[J]. Clin Sci， 2017，131：1059-1068.

[3] Snowden J. Vascular cognitive impairment：Preventable dementia[J]. Journal of Neurology Neurosurgery & Psychiatry，2005，75（6）：941.