仔猪体内姜黄素对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的作用评价

吴小萍，房军洋，郭忠义，陈 旭，穆 杨，杜涛峰

(西北农林科技大学 动物医学学院，陕西 杨凌 712100)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种重要的猪传染病，主要临床特征是母猪繁殖障碍和各年龄段的猪呼吸系统症状。1995年，首次证实我国猪群中存在PRRSV感染[1]，2006年，我国暴发了高致病性PRRS，其高发病率和高死亡率给我国的养猪业造成了严重危害[2]。现阶段，PRRSV的2个基因型(美洲型和欧洲型)在我国都有流行，并且，由于PRRSV进化具有高突变的特点，使得新的变异毒株不断的出现，而且存在严重的混合感染现象，因此，PRRS对我国养猪业的危害依然存在[3]。虽然自我国首次报道该病以来，至今流行已有20多年，但目前尚无安全有效的PRRSV疫苗。

姜黄素是一种具有多种生物学活性的天然化合物，在体外试验已证实，姜黄素具有抗多种病毒的活性，包括乙型脑炎病毒[4]、丙型肝炎病毒[5-6]、乙型肝炎病毒[7-8]、裂谷热病毒[9]、呼吸道合胞体病毒[10-12]、Ⅱ型登革热病毒[13]、基孔肯雅病毒、水泡性口炎病毒[14]、寨卡病毒[15]和流感病毒[16-17]。动物试验方面，给H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)感染的火鸡喂食姜黄素与百里香醌，可显著抑制H9N2 AIV的致病作用[18]，姜黄素可抑制弗云德鼠白血病病毒感染引起的BALB/c小鼠红白血病病情的发展[19]。本课题组前期的研究中，已证实姜黄素在细胞水平可抑制PRRSV的增殖[20-21]，本研究将进一步探讨姜黄素在PRRSV感染仔猪中的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒和试剂Marc-145细胞在含有100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素(Sigma-Aldrich)和10%胎牛血清的DMEM中培养 (biological industries)，培养条件为37℃、5%的CO2和95%的湿度;高致病性PRRSV毒株 HuN4 (GenBank ID:EF635006)在Marc-145细胞上增殖和滴度测定;姜黄素购自Sigma-Aldrich。

1.2 动物试验12头4周龄PRRSV阴性的健康仔猪随机分为3组，每组4头猪，分别在3个隔离的房间。第1组为姜黄素治疗组，3×105TCID50/头PRRSV攻毒后，姜黄素拌料喂食，剂量为1 g/(头·d)；第2组为PRRSV攻毒组；第3组为未攻毒组。每天测量直肠温度并记录，于攻毒后3，7，14，21 d收集血清进行病毒载量的检测，攻毒后7，14，21 d的血清用于PRRSV特异性抗体的检测。

1.3 荧光定量逆转录PCR利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit (全式金)提取血清中的PRRSV RNA，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)说明书反转录RNA为cDNA后，SYBR®Premix Dimer Eraser(TaKaRa)和qTOWER 2.2(Analytik Jena Life Science)分析PRRSV N基因的表达。PRRSV N基因特异性引物序列,其中正向引物：5′-AGATCATCATCGCCCAACAAAAC-3′；反向引物：5′-GACACAATTGCCGCTCACTA-3′。

1.4 PRRSV特异性抗体的检测仔猪血清中PRRSV特异性的抗体应用IDEXX PRRS X3 Ab Test进行检测，结果判定临界值为0.4。S/P值大于0.4，结果判定为阳性；S/P值小于0.4，结果判定为阴性。

1.5 淋巴细胞增殖试验于攻毒后14 d，用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，细胞密度调整至5×106/mL，100 μL/孔铺板于96孔板，然后每孔加入10 mg/L纯化的PRRSV，于37℃、5% CO2和95%湿度细胞培养箱中培养72 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育2 h，分光光度计测定D450 nm值。

1.6 数据分析用GraphPad Prism 软件进行数据分析，t检验被用于分析两组数据的差异性。P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 姜黄素对PRRSV感染后仔猪直肠温度的影响从攻毒前2 d开始测量仔猪的直肠温度并记录，结果如图1所示。攻毒前2 d，15头猪的直肠温度都在正常范围;从攻毒后1 d开始， PRRSV攻毒组和姜黄素治疗组仔猪的直肠温度开始高于未攻毒组;从攻毒后6～11 d，PRRSV攻毒组和姜黄素治疗组每头仔猪的直肠温度都达到39.5℃及以上;攻毒后23 d，PRRSV攻毒组和姜黄素治疗组仔猪的直肠温度趋于与未攻毒组一致。结果表明，姜黄素拌料喂食PRRSV感染后的仔猪，对仔猪直肠温度升高没有显著影响。

图1 攻毒后仔猪直肠温度

2.2 姜黄素对PRRSV感染后仔猪病毒血症的影响收集攻毒后3，7，14，21 d仔猪的血清，通过检测血清中病毒的拷贝数，评价姜黄素对PRRSV感染后仔猪病毒血症的影响。结果表明，在攻毒后3，7，14 d，姜黄素治疗组与PRRSV攻毒组相比，血清中病毒的拷贝数无显著差异(图2A～C)，而攻毒后21 d，姜黄素治疗组血清中病毒的拷贝数显著低于PRRSV攻毒组(图2D)。

图2 攻毒后3(A)，7(B)，14(C)，21 d(D)仔猪血清中PRRSV载量水平 用t检验分析法计算P值;ns代表无显著差异;*代表P< 0.05

2.3 姜黄素对PRRSV感染后仔猪体内PRRSV特异性抗体的影响在PRRSV攻毒后7，14，21 d，收集仔猪血清检测PRRSV特异性抗体的产生情况。结果表明，在攻毒后7，14，21 d，PRRSV攻毒组和姜黄素治疗组S/P值都大于0.4，检测结果都为抗体阳性，在攻毒后14 d，S/P值达到峰值。与PRRSV攻毒组相比，姜黄素治疗组S/P平均值整体都高于PRRSV攻毒组。未攻毒组S/P值都小于0.4，检测结果为抗体阴性(图3)。

2.4 姜黄素对PRRSV特异性淋巴细胞增殖的影响在PRRSV攻毒后14 d，收集血液，分离外周血单核细胞，通过CCK-8法检测姜黄素是否诱导PRRSV特异性的淋巴细胞增殖。结果表明，与PRRSV攻毒组相比，姜黄素拌料饲喂PRRSV感染后的仔猪可显著诱导PRRSV特异性的淋巴细胞增殖(图4)。

3 讨论

在抗PRRSV研究方面，一些草本提取物具有抗PRRSV的活性。表没食子儿茶素没食子酸酯，一种在绿茶中提取的类黄酮化合物，其人工合成的类似物可以抑制PRRSV在Marc-145细胞中的复制[22]。丹参根茎的提取物丹参酮ⅡA可通过抑制PRRSV N基因的表达和PRRSV诱导的自噬抑制PRRSV在Marc-145细胞中复制[23]。茶叶中的粗提物茶皂素也可以通过类似丹参酮ⅡA的作用途径抑制PRRSV的复制[24]。另外，金银花抗病毒的主要成分之一绿原酸和主要存在于黄芩中的一种黄酮类化合物黄芩素可通过抑制PRRSV在Marc-145细胞中早期阶段的复制或直接灭活病毒发挥抗PRRSV的功能[25]。姜黄素为姜黄根的提取物，在体外也表现出良好的抗PRRSV活性[20-21]。虽然，这些草本提取物在体外都具有良好的抗PRRSV活性，但大部分目前都局限于体外研究，是否在体内也具有抗PRRSV活性，还需要进一步的研究。

图3 攻毒后7，14，21 d，仔猪血清中PRRSV特异性抗体水平 S/P>0.4，检测结果为阳性;S/P<0.4，检测结果为阴性

图4 攻毒后14 d PRRSV特异性淋巴细胞增殖水平 用t检验分析法计算P值( ***代表P< 0.001)

本研究主要探讨了姜黄素在PRRSV感染仔猪中的作用，以拌料饲喂的方式给药，虽然在攻毒后14 d，姜黄素可显著诱导PRRSV特异性的淋巴细胞增殖，但不能显著增强PRRSV特异性抗体的产生，从而使仅在攻毒后21 d，姜黄素可显著抑制血清中的病毒拷贝数。在攻毒后3，7，14 d，姜黄素不能抑制血清中的病毒拷贝数，而且姜黄素也不能降低PRRSV感染引起的体温升高。依据姜黄素在啮齿类动物体内生物利用率的特点[26-28]，姜黄素对PRRSV感染仔猪的治疗效果不甚理想的原因可能是姜黄素以口服的方式使用，姜黄素在仔猪体内的吸收率比较低，而且大部分姜黄素可能会被机体迅速清除。

虽然不同的动物试验已经证明，姜黄素具有较高的安全性，但姜黄素生物利用率低阻止了其在临床上的应用。目前，已有几种策略被用于增强姜黄素的生物利用率，包括纳米颗粒药物传递系统，脂质体药物传递系统，可抑制姜黄素新陈代谢的佐剂，可以增强姜黄素胃肠道吸收的胶团和磷脂，以及磷脂复合物技术[29]。本研究结果表明，在仔猪体内姜黄素对PRRSV感染具有一定的抑制作用，下一步将通过增强姜黄素在猪体内的生物利用率，提高姜黄素在猪体内对PRRSV感染的治疗效果。