高效液相色谱法同时测定川归补肾通络胶囊中2 种成分的含量

2020-02-21朱应成梁朝锋

中国医药导报 2020年1期

余静朱应成祁俊梁朝锋徐斌

安徽省芜湖市中医医院制剂室，安徽芜湖 241000

川归补肾通络方（丹参、炮山甲、龟甲、龙血竭、当归、川芎、地龙、土鳖虫、鹿茸、人中黄、淫羊藿、肉桂、三七、冰片、海星），具有补益肝肾、活血通络、强筋健骨、行气止痛之功效，临床应用于血瘀、肝肾亏虚型股骨头缺血性坏死，症见疼痛、活动不利、骨不愈合等。

本课题组已在前期研究中建立了川归补肾通络胶囊的质量标准[1]，并运用现代中药制药技术将其制备成适合大生产的川归补肾通络胶囊。但由于中药复方制剂的药味较多，具有多成分多靶点的特点，各成分有其独特的药理活性，因此中药制剂的疗效亦是方中众多共存活性成分相互作用的结果，若仅采用单一指标成分进行评价，恐难以全面把控中药复方制剂的内在质量、临床疗效。因此，本研究选取本方的代表药材丹参中的两个主要活性成分丹酚酸B 和丹参酮ⅡA[2-6]，作为川归补肾通络胶囊的质量评价指标，建立高效液相色谱法同时测定其含量的方法，共同监控本制剂的质量。

1 仪器与试药

Waters e2695 型高效液相色谱仪[含二极管阵列检测器（PDA），美国沃特世公司]；万分之一电子天平（XP-205、AL-204，梅特勒-托利多仪器有限公司）。

川归补肾通络胶囊（安徽省芜湖市中医医院自制，规格：0.3 g/粒，批号：180801、180802、180803）；丹酚酸B 对照品、丹参酮ⅡA 对照品均购自中国食品药品检定研究院（批号分别为：111562-201212、110766-2010619，纯度分别为95.4%、100%）；甲醇、乙腈和磷酸为色谱纯；水（“娃哈哈”纯净水）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)；流动相A 为乙腈（A）、B 为0.1%磷酸溶液，二元梯度洗脱：0～16 min A：24%，17～32 min A：75%，33～35 min A：24%；流速为1.0 mL/min；检测波长为270 nm（丹参酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）；柱温为20℃；进样量：10 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取丹酚酸B 46.99 mg 至50 mL 量瓶中，丹参酮ⅡA 对照品19.20 mg至200 mL 量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为896.6、96 μg/mL 的丹酚酸B 对照品储备液、丹参酮ⅡA 对照品储备液。精密吸取丹酚酸B对照品储备液5 mL 及丹参酮ⅡA 对照品储备液1 mL 共同加入至10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得到丹酚酸B 及丹参酮ⅡA 浓度分别为448.3、9.6 μg/mL 的混合对照品溶液，冷藏保存，使用前经0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.2.2 供试品溶液的制备取装量差异项下的川归补肾通络胶囊内容物，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率350 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，使用前经0.22 μm 微孔滤膜过滤。

2.2.3 阴性样品溶液的制备按处方比例称取缺丹参的其余药材，按本制剂的制备工艺制成缺丹参的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制成阴性空白溶液。

2.3 专属性试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。供试品色谱中，在与各对照品色谱峰相应保留时间处有吸收峰，各待测成分与相邻色谱峰分离度均＞1.5，而阴性样品溶液中未见相应待测成分色谱峰。见图1。

2.4 线性关系的考察

图1 川归补肾通络胶囊HPLC 色谱图

分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mL 至2 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以对照品浓度（μg/mL）为横坐标（X），以对照品峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果丹酚酸B 的回归方程为Y=12 650X-1973.3（r=0.9996）、丹参酮ⅡA 的回归方程为Y=54 274X+22 206，（r=0.997）。结果表明，丹酚酸B 进样浓度在44.83～448.30 μg/mL 范围内，丹参酮ⅡA 进样浓度在0.96～9.60 μg/mL 范围内呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹参酮ⅡA 49 μg/mL），按“2.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，结果丹酚酸B、丹参酮ⅡA 的峰面积RSD 均为0.4%，表明该仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密吸取混合对照品溶液（丹酚酸B 44.83 μg/mL、丹参酮ⅡA 49.0 μg/mL），按“2.1”项下色谱条件，分别于1、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图，结果丹酚酸B、丹参酮ⅡA 峰面积RSD 分别为1.3%、1.5%，表明在24 h 内各化合物稳定性良好。

2.7 重复性试验

取川归补肾通络胶囊内容物（批号：180801）共6 份，每份约1 g，精密称定，分别置于6 个50 mL 置具塞锥形瓶中，按照“2.2.2”项下方法制备6 份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按外标法计算丹酚酸B、丹参酮ⅡA 的含量分别为7.65 mg/g、211.77 μg/g，RSD 分别为1.1%、0.7%。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的川归补肾通络胶囊内容物（批号：180801）共6 份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于6 个50 mL 量瓶中，分别精密加入丹酚酸B 对照品储备液、丹参酮ⅡA 对照品储备液适量，加70%甲醇至刻度，按照“2.2.2”项下方法进行制备，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。丹酚酸B、丹参酮ⅡA的平均加样回收率分别为99.7%、97.4%，RSD 分别为1.9%、1.7%。见表1。

表1 加样回收试验结果（n=6）

2.9 样品含量测定

分别取3 批川归补肾通络胶囊内容物（批号：180801、180802、180803）约1 g，精密称定，置于50 mL具塞锥形瓶中，按照“2.2.2”项下方法进行制备，按“2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法计算丹酚酸B、丹参酮ⅡA 的含量。见表2。

表2 3 批样品含量测定结果（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 指标性成分的选择

川归补肾通络方中丹参具有补气升阳、生津养血、行滞通痹的功效，可用于治疗气虚乏力、中气下陷、血虚萎黄、半身不遂、痹痛麻木等症[7]。主要化学成分有丹参酮、丹参酚酸类、挥发油及无机元素等，其中以水溶性成分丹酚酸B 和脂溶性成分丹参酮ⅡA 最具有代表性，发挥抗炎、抗血栓、改善血液循环[5]，促进成骨细胞分化、增殖等药理作用[8-12]，是川归补肾通络胶囊治疗股骨颈骨折术后股骨头缺血性坏死的重要药效物质基础。因此，本研究选择丹酚酸B、丹参酮ⅡA 作为川归补肾通络胶囊含量测定的指标性成分。

3.2 检测波长的选择

本研究利用二极管阵列检测器对丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 进行光谱扫描，得到2 个待测组分在210～400 nm 波长范围内的紫外吸收图谱，确定各成分的最大吸收波长，并结合相关文献[13-14]，采用双波长同时测定，保证2 个待测成分均在最大吸收波长下检测，检测灵敏度高、干扰小，检测波长分别为270 nm（丹参酮ⅡA）、286 nm（丹酚酸B）。

3.3 流动相的选择

已有文献报道高效液相色谱法定量测定含丹参中药制剂中的丹酚酸B 和丹参酮ⅡA，常采用乙腈-磷酸水[15-17]、乙腈-甲酸水[18-19]、甲醇-磷酸水[20]等流动相系统进行洗脱。本研究考察了乙腈、甲醇、磷酸、水等多个不同组合，经过对比选取乙腈-0.1%磷酸水作为流动相，并优化梯度洗脱条件，在一个流动相系统下实现丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的良好分离，且峰形对称，与相邻色谱峰未见干扰[21-24]。

3.4 样品提取工艺的选择

本研究以丹酚酸B 和丹参酮ⅡA 的含量为评价指标，单因素考察了川归补肾通络胶囊的提取方式（超声、回流）、提取时间（0.5、1 h）、提取溶剂（70%甲醇、90%甲醇），确定川归补肾通络胶囊的最佳提取工艺为加70%甲醇50 mL 超声处理30 min[21]。该样品前处理条件简便，可有效避免因前处理过程繁琐而造成的含量测定结果误差。