枸杞山药凝固型酸乳的发酵工艺研究

王茹，方海田，*，刘慧燕，马若霜，周婷，刘予煊，魏珊珊，李金娜，赵贝贝，胡晓磊，安广颖

（1.宁夏大学宁夏食品微生物应用技术与安全控制重点实验室，宁夏银川750021；2.宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

枸杞，也称枸杞子，具有滋补肝肾、调节血糖血脂血压、提高免疫力[1]、降低胆固醇[2]、抑制肿瘤等多方面药理功效[3-4]。山药为药食两用的植物[5]，具有抗氧化[6-7]、降血糖、血脂[8]、助消化、健脾益胃[9-10]等功效。由于酸奶具有营养价值高、口味独特、易消化和吸收，在抑制肠道内腐败菌的繁殖、防癌、防衰老等特点，具有一定的保健作用[11-13]。

目前，关于枸杞酸奶[14-18]和山药酸奶[19-23]等加工工艺研究越来越多，关于山药和枸杞为原料加工酸奶的研究工艺鲜少报道，且大多以感官评价作为唯一评价指标，并未全面地考虑酸奶的各个理化特性及品质。而响应面结合主成分分析是以主成分综合得分作为判定指标，将多响应问题转化为单响应问题，不仅可以降低单一目标优化试验的工作量，还能能获得较好的工艺条件[24]。

由于植物乳杆菌不仅在果蔬汁中发酵中适应性较强，而且多种果蔬汁经植物乳杆菌发酵后，在感官、卫生、营养、货架期等性质方面都得到提升[25-26]。因此，本研究使用保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和植物乳杆菌对鲜牛奶、枸杞汁和山药汁进行发酵，进而对枸杞山药凝固型酸乳的发酵工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞、山药、鲜牛奶、白砂糖、小苏打：市售；异抗坏血酸钠（食品级）：特正商贸有限公司；保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌：宁夏大学农学院生物实验室保存；考马斯亮、牛血清蛋白、浓硫酸、葡萄糖、苯酚、芦丁：北京索莱宝科技有限公司。

RZ-988eRoyalstar 打浆机：合肥荣事达小家电公司；PB-LO pH 计：赛多利斯科学仪器有限公司；PLDHDE2.0 手持糖量计：陕西普洛帝测控技术有限公司；SBA-40E 生物传感分析仪：山东省科学院研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌的活化与扩大培养

将甘油保存的保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌和植物乳杆菌分别在接种在MRS 固体培养基上，37 ℃恒温培养8 h～10 h 后取出，重复3 次，使其充分活化。

用接种环挑取固体培养基上的单菌落，接入MRS液体培养基中，37 ℃恒温，振荡培养8 h～10 h 后取出，按照接种量1%接入三角瓶中进行扩大培养（37 ℃，8 h～10 h），即可得到所需菌悬液，然后把3 种菌液按照体积比为 1 ∶1 ∶1 混合后，备用。

1.2.2 枸杞山药乳酸菌发酵凝固型酸乳工艺流程

挑选肉厚，无腐烂的中宁枸杞和新鲜无虫害的山药，用流动水多次冲洗，洗掉粘在枸杞和山药表面的污垢，枸杞按照料液比 1 ∶5（g/mL）加水，浸泡 8 h～9 h，加入护色剂（0.05%的异抗坏血酸钠），打浆后过滤，得到枸杞汁。山药去皮切块后，按照料液比1 ∶5（g/mL），加入护色剂（0.05%的异抗坏血酸钠），打浆后过滤，得到山药汁。将鲜牛奶，枸杞汁，山药汁和白砂糖混匀，采取巴氏杀菌法（65 ℃，25 min～35 min）杀菌。杀菌结束后，将制备好的菌液，按一定的接种比例接入牛奶中，42 ℃恒温发酵 4 h～5 h，取出，冷却后熟（4 ℃，12 h），得到成品。

1.2.3 枸杞山药凝固型酸乳的单因素试验

固定牛奶200 mL，山药汁添加量为10%，发酵剂5 %，试验枸杞汁添加量在不同梯度下（8 %、10 %、12 %、14%、16%）对枸杞山药凝固型酸乳感官评价的影响；固定牛奶200 mL，枸杞汁添加量12 %，发酵剂5 %，考察山药汁的添加量在不同梯度下（6 %、8 %、10%、12%、14%）对枸杞山药凝固型酸乳感官评价的影响；固定牛奶200 mL，枸杞汁添加量12%，山药汁添加量10%，试验接种量在不同梯度下（3%、4%、5%、6%、7%）对枸杞山药凝固型酸乳感官评价的影响。

1.2.4 响应面试验

基于单因素试验，确定枸杞汁添加量（A），山药汁添加量（B），接钟量（C）3 个因素的水平值，使用 Design-Expert 10.0.7 软件进行分析。具体见表1。

表1 枸杞山药凝固型酸乳工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Test factors and levels of optimization response surface of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam fermentation process

1.3 测定方法

1.3.1 感官评价

枸杞山药凝固型酸乳加工后，请15 位有丰富评定经验的专业人员组建感官评定小组，通过表2 分别从色泽、滋味、协调性和组织状态对枸杞山药凝固型酸乳进行综合评定，总分为100 分，最后取平均值，具体见表2。

表2 枸杞山药凝固型酸乳感官品质评分标准Table 2 Evaluation standard of sensory quality of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

1.3.2 理化指标的测定

pH 值的测定：精密pH 计；可溶性固形物测定：手持糖量计；乳酸测定：生物传感分析仪直接测定；蛋白质测定：考马斯亮蓝G-250 法测定[27]；总黄酮测定：紫外分光光度法测定[28]；总糖测定：苯酚-浓硫酸法测定[29]。

1.3.3 微生物指标的测定

GB/T 4789.18-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验》[30]。

1.3.4 主成分提取与数据处理

对枸杞山药凝固型酸乳的各个指标进行主成分分析，提取特征值大于1 的因子，得到特征值、贡献率和累积贡献率，枸杞山药凝固型酸乳的综合评分和规范化综合评分分别按照公式（1）和公式（2）计算。

式中：F 为综合得分；F1、F2和 F3分别为主成分 1、2和 3 的得分；Y1、Y2、Y3分别为各个主成分的特征值；C为累积特征值；Z 为规范化综合得分；Fmax为综合得分最大值；Fmin为综合得分最小值。

对响应面的试验设计和结果分析使用Design-Expert 10.0.7 软件进行处理，采用IBM SPSS Statistics 17.0 软件对主成分[31-34]进行因子分析。

2 结果与分析

2.1 单因素结果与分析

2.1.1 枸杞汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响

枸杞汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响见图1。

图1 枸杞汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响Fig.1 Effect of Lycium barbarum juice addition on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

由图1 可知，添加的枸杞汁为12%时，感官评分为92.3 分，达到最大值，随后感官评分迅速下降。可能是因为当添加的枸杞汁低于12%时，复合酸乳风味不显著，突出山药风味，缺少枸杞的香甜，当添加的枸杞汁高于12%时，随着枸杞汁添加量的增大，出现枸杞臭，奶香味较淡，且酸奶的凝乳效果不佳，从而影响感官评分，故选取最佳的枸杞汁添加量为10%、12%、14%。

2.1.2 山药汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响

山药汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响见图2。

图2 山药汁添加量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响Fig.2 Effect of Chinese yam juice addition on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

由图2 可知，添加的山药汁为10%时，感官评分为91.8 分，达到最高，随后感官评分迅速下降。可能是因为当添加的山药汁低于10%时，山药风味不显著，仅有酸奶固有的奶香味和枸杞的甜味，当添加的山药汁高于10%时，随着山药汁添加量的增大，奶香味较淡，酸奶的凝乳效果变差，从而影响感官评分，故选取山药汁添加量为10%左右最为合适。

2.1.3 接种量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响

接种量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响见图3。

由图3 可知，当接种量5%时，产品的感官评分为92 分，达到最高值。当接种量低5%时，酸奶的硬度不够，凝乳效果不佳，当接种量高于5%时会造成酸奶的硬度过大，口感粗糙，酸奶会带有本身的酸臭感，从而影响感官评分，因此，最适的接种量的范围在5%左右。

2.2 响应面试验结果

图3 接种量对枸杞山药凝固型酸乳感官评分的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on sensory score of the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

根据Box-Behnken 中心组合设计，在单因素试验基础上，以枸杞汁添加量（A），山药汁添加量（B），接种量（C）为试验因素，进行响应面试验设计，共17 个试验点，试验设计及结果见表3。

2.3 枸杞山药凝固型酸乳主成分分析

采用IBM SPSS Statistics 17.0 软件对表3 中枸杞山药凝固型酸乳各指标数据进行主成分分析。根据大于85%的累积贡献率原则，提取了2 个主成分，累计贡献率达到89.05%，可以较全面反映枸杞山药凝固型酸乳的品质信息。由各个指标特征向量绝对值的大小看出，决定第1 主成分的主要指标是乳酸含量、蛋白质含量和乳酸菌数；决定第2 主成分的主要指标是感官评价。结果见表4。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design and results

为消除量纲的影响，对综合评分进行规范化处理，得到规范化综合评分，见表5，再以该评分作为响应值进行响应面分析。

2.4 规范化综合评分的响应面分析

根据Box-Benhnke 中心组合设计原理，以规范化综合得分为响应值，利用Box-Behnken 10.0.7 对数据分析，回归拟合后，得到回归方程为：

表4 枸杞山药凝固型酸乳中主成分的特征值及贡献率Table 4 Characteristic value and contribution rate of principal components in the solidifying yoghurt with Lycium barbarum and Chinese yam

表5 主成分得分值与规范化综合评分Table 5 Principal component scores and standardized score

Y=0.98+0.016A+0.009 575B+0.19C-0.12AB+0.045AC+0.093BC-0.11A2-0.15B2-0.55C2

该模型P＜0.01，说明该模型极显著；失拟误差P＞0.05，说明没有产生失拟现象。R2为0.998 6，说明拟合度良好，方程的显著性及可靠性极高，进一步说明该方程模拟的试验分析是可行的。对规范化综合评分有极显著影响的有一次项C，交互项AB，AC，BC，平方项A2，B2，C2，对规范化综合评分有显著影响有一次项 A。根据F 值大小，可知影响枸杞山药凝固型酸乳质量的排序：C＞A＞B，即接种量＞枸杞汁添加量＞山药汁添加量。回归模型及方差分析见表6。

各因素间交换作用见图4。

由图4 可知，枸杞、山药添加量的响应曲面等高线呈椭圆形，表明枸杞汁和山药汁两者交互作用变化明显。由接种量与枸杞汁添加量的响应曲面坡度可知，接种量的响应曲面坡度和枸杞汁添加量的响应曲面坡度较明显，其等高线呈椭圆形，表明接种量与枸杞汁添加量两者交互作用变化非常明显。由接种量与山药汁添加量的响应曲面坡度可知，接种量的响应曲面坡度和山药汁添加量的响应曲面坡度较明显，其等高线呈椭圆形，表明接种量与山药汁加量两者交互作用非常显著。

表6 以规范化综合评分为响应值的回归模型及方差分析Table 6 Regression model and variance analysis with sensory score as response value

图4 各因素间的交互作用Fig.4 Interactions between the reaction factors

2.5 优化发酵工艺条件的确定及验证

使用Design-Expert 10.0.7 软件中的optimization分析，得到枸杞山药凝固型酸乳优化工艺条件：在鲜牛乳中，枸杞汁添加量12.18%，山药汁添加量10.12%，接种量5.18%，此条件下枸杞山药凝固性型酸乳的规范化综合得分为0.993 4。为了验证模型预测理论值的准确性和真实性，同时为了方便实际操作，将最佳发酵工艺的条件调整为枸杞汁添加量为12%、山药汁添加量为10%、接种量为5%，在此优化条件下试验，得到规范化综合评分0.993 2，与预测值误差很小，因此，运用响应面法对枸杞山药凝固型酸乳的工艺条件的优化更准确合理，更具有实际指导意义。

2.6 发酵乳产品质量指标

2.6.1 感官指标

呈现均匀的淡粉色，凝乳均匀，光滑细腻，酸甜爽口，有淡淡的枸杞和山药的风味，具有发酵乳独特的香味。

2.6.2 理化指标

pH 值4.15，可溶性固形物23.5%，乳酸含量达321 mg/100 mL，蛋白质量3.2 g/100 g，总黄酮含量6.81 mg/100 mL。

2.6.3 微生物指标

乳酸菌数为2.8×108CFU/mL，致病菌，未检出。

3 结论

本试验以鲜牛乳，枸杞汁和山药汁为试验材料，并选择保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌和植物乳杆菌进行发酵来优化枸杞山药凝固型酸乳的发酵工艺。得到的最优发酵条件为：在鲜牛乳中，枸杞汁添加量为12 %、山药汁添加量为10%、接种量为5%。

枸杞山药凝固型酸乳的研制不仅增加了牛奶的营养成分和保健功能，还丰富了乳品市场，丰富了枸杞和山药的加工途径。本研究通过响应面－主成分分析法枸杞山药凝固型酸乳的理化指标和感官评分结合起来，有效解决了多指标评价参数的问题。解决了以感官评价作为酸乳品质评定的单一性，相较于其他酸乳的工艺而言，本研究更加全面地考虑了枸杞山药酸乳的各个理化特性对枸杞山药酸乳的品质影响，使得到的枸杞山药凝固型酸乳的工艺条件更可靠，更具有实际生产意义。