类弹性蛋白作为功能纳米材料在生物工程领域研究及应用进展

周阳 王桃桃 闫丹丹 王莹莹 施沁璇 孙丽慧 林锋

（1.江苏大学生命科学研究院，镇江 212013；2.浙江淡水水产研究所 农业部淡水健康养殖重点实验室，湖州 313001）

弹性蛋白（Elastin）是一种细胞外基质，为组织和器官提供完整的结构，且具有高度交联和不溶的性质，可为许多脊椎动物组织提供弹性［1］。1973年，研究人员从缺乏铜的猪动脉中分离出水溶性弹性蛋白，其中含有大量的VPGVG重复氨基酸序列，后根据弹性蛋白的疏水区特性合成了一种含有重复氨基酸序列（VPGVG）的蛋白质聚合物——类弹性蛋白（Elastin-like polypeptide，ELP），主要由五肽重复序列单元组成，其基本结构为Val-pro-gly-xaa-gly，缩写为（VPGXG）n，其中“X”为除脯氨酸外的任何天然氨基酸可占据的客体残基（脯氨酸替代可导致ELP失去可逆的热相变功能）；n为五肽重复序列的次数［2］。

基于ELP标签的可逆相变循环（Inverse transition cycle，ITC）是一种新型的重组蛋白非色谱分离纯化技术，利用ELP融合蛋白的可逆热相变特性，经过重复多次ITC从可溶性全蛋白溶液中特异地分离出ELP融合蛋白。由于在基因水平上可精确地控制ELP氨基酸序列、分子量、空间折叠结构以及相应的生化性质，同时ELP化学结构与天然弹性蛋白相似，本身具有良好的细胞相容性、并能够在体内自然降解成对生物体无毒的、内源性的氨基酸，这种可人工控制的理化性质和良好的生物相容性，使ELP在新型生物医学材料的应用方面具备十分广阔的研究前景。重点阐述了ELP相变特性及机理；ELP融合蛋白的设计；ELP融合蛋白对蛋白质（多肽）活性影响；ELP标签在蛋白质纯化、生物医药、生物工程、水凝胶及新兴领域方面的应用；ELP最新研究进展及发展方向。

1 ELP相变特性及机理

1.1 ELP的热相变特性

ELP对pH值、盐离子浓度及温度非常敏感，引起疏水-亲水结构的转化，表现为可反复发生可逆相变过程。ELP在低临界溶液温度下表现出快速的可逆相变性质，该临界温度称为相变温度（Inverse temperature transition，Tt）。相变过程温度响应跨界仅仅2-3℃。当溶液温度低于Tt时，ELP聚合物链无序延伸，在水溶液中以单体形式溶解；当溶液温度高于Tt时，ELP单体会聚集在一起，形成微米大小的可见颗粒，并从水溶液中析出。当溶液温度再次下降到Tt以下时，ELP再次溶解在溶液中［3-4］。孙利慧［5］报道25 μmol/L的ELP30、ELP40和ELP50相变温度分别为32.5、29.5、25.5℃。1.25 mol/L的NaCl分别使25 μmol/L的ELP30、ELP40相变温度分别降至15.5℃和11℃。0.4 mol/L的（NH4）2SO4使25 μmol/L的ELP50相变温度最低降至7.5℃。

1.2 ELP的相变机理

当溶液的温度低于Tt，ELP呈松散无序，VPGXG中的Pro-gly是β-转角结构，而ELP中的极性基团通过氢键与水分子结合。同时在ELP疏水基团斥力的影响下，疏水基团与水分子之间的氢键键合作用得到加强，形成有序的水分子。当溶液温度高于Tt，温度逐渐上升，疏水性基团周围的有序水分子之间的氢键被大大削弱，因此呈现无序状态。另一方面，因为疏水基团之间的疏水性增强，在水溶液中会看到ELP多肽链从随机无序的结构聚集形成有序的II型β-转角结构［6］。短ELP衍生肽（一般1-5重复）已经显示出具有相似的温度敏感的构象［7］，单个VPGVG单元可充当热力学独立单元，以进行温度诱导的β-转角转变。在可逆热相变中，多肽和多肽间、溶剂和多肽间相互作用、末端的基团和电荷引起ELP链二级结构的明显改［8］。

1.3 ELP的Tt影响因素

ELP的相变行为受摩尔数、分子量、普通溶质、浓度及客体残留类型等多种因素的影响。客座残基的选择将直接影响ELP的逆相转变温度，亲水性客座残基会增加ELP的Tt，而疏水性客座残基会降低ELP的Tt。Trabbic-Carlson等［9］比较不同ELP融合蛋白的Tt发现，Tt的变化与融合伴侣的表面疏水性相关联，第4位客座残基与带电荷侧链的结合和在多肽链上分布也会引起Tt改变。

当客座残基位置掺入可电离氨基酸时，ELP的LCST行为对pH敏感。Lin等［10］构建了两个包含客体残基的Glu或His的ELP系列，结果表明最低临界相容温度（Lower critical solution temperatur，LCST）行为在各自的pKa值附近对pH敏感，是可电离氨基酸质子化或去质子化的结果。当可电离的氨基酸带有电荷时，由于总疏水性的降低，ELP显示出更高的Tt值。在可电离残基不带电的pH值下，增加的疏水性导致较低的Tt值。Mills等［11］研究了5种不同的ELP-mCherry融合蛋白的溶液相变行为，阐明ELP电荷和疏水性对融合蛋白自组装的影响。结果表明与不带电的ELP的融合产生了最佳的周期性纳米级排列；而正负电荷分布平衡的平衡电荷ELP没有明显的有序排列，在高浓度下是高度双折射；ELP电荷特性比ELP块的疏水性更能预测自组装。因此，在设计ELP时可以直接通过选择客座残基的类型和频率来设计含有不同Tt的ELP。ELP这种特性已用于开发具有可交联赖氨酸和半胱氨酸残基的ELP，并生成具有不同转变温度且能够经历多个温度诱导的转变的ELP融合蛋白［12］。

对于分子量已知的ELP，在溶液中的浓度会影响其相变温度，ELP浓度越高Tt越低［13］。盐离子对ELP的Tt的影响遵循霍夫迈斯特离子序（Hofmeister series），阳离子：NH4+>K+>Na+>Mg2+>Ca2+>Mn2+>Cu2+；阴离子。

2 ELP融合蛋白的设计

根据ELP的Tt对多个变量敏感，可以精确设计不同组成和长度，因而具有特定相变温度的ELP，并根据hofmeister series离子序列规律选择合适的盐离子进一步调节Tt。

2.1 ELP标签的长度（n的重复数）

ELP融合蛋白的Tt随着ELP的序列，大小和浓度以及融合伴侣的疏水性和水溶液的离子强度而变化。ELP的链长［14］和客座残基［15］是影响Tt的两个重要参数。疏水性客体残基和链长越大，Tt越低；而亲水性客体残基和链长越小，Tt越高。选择正确的ELP标签对目的蛋白的分离纯化条件和效率至关重要。Tt太高的ELP融合蛋白在加热纯化过程中易使目的蛋白变性失活，增加融合蛋白中疏水性氨基酸的比例能够降低Tt，但疏水性过强的ELP在相变时会增加杂蛋白的含量。融合蛋白中过长的ELP标签会降低目的蛋白的比例，从而降低目的蛋白的表达量［16］。所以，设计合适的ELP标签，同时选择合适的盐离子和溶液温度是优化ITC分离纯化条件以及提高效率的首要任务，开发在温和条件下就能高效分离重组蛋的最短ELP标签尤为重要。Meyer等［14］构建了n为20-330的ELP，然而ELP长度显著性影响体系原子总数，实际使用n一般不低于20，建议ELP标签的长度n为20-100。

2.2 ELP标签与目的蛋白的相对位置

目前对于目标蛋白N端或C端的ELP标签设计没有固定的模式，取决于靶蛋白性质。如果目标蛋白的表达水平很高，N端ELP标签会干扰目标蛋白正常折叠，C端标签设计可能更合适。ELP的翻译要在目标蛋白翻译后才开始，因此避免了对目标蛋白折叠的干扰。如果靶蛋白的表达水平相对较低，则设计靶蛋白N端的标签，可以增加靶蛋白的可溶性表达，可能是通过和未折叠成熟的蛋白质链之间的疏水作用，帮助了正确的目标蛋白质折叠，并通过空间立体效应，防止目的蛋白折叠时中间态分子之间的集聚［17］。Cho等［18］构建表达protein-ELP（C-terminus）和protein-ELP（N-terminus）融合蛋白，结果表明protein-ELP融合蛋白表达量高于ELPprotein融合蛋白；此外细胞溶解液中可溶性protein-ELP的融合蛋白浓度高于ELP-protein融合蛋白。因此，纯化标签应优先远离蛋白质的受体结合区域放置。如果后者远离N-末端或C-末端，则可以使用任一末端。如果特定的生物药物蛋白质在C端或附近具有其结合表位，则ELP纯化标签这种优选的单向定位可能成为一种限制因素，需要进一步研究。

3 ELP标签对融合蛋白的影响

3.1 不改变融合蛋白二级结构及酶活

ELP融合蛋白能增加蛋白溶解性，维持其生物活性和物理性质。Floss等［19］报道了scfv-ELP融合蛋白的表达可以达到非常高的水平，且ELP不影响完整抗体的装配、折叠和抗原结合特性。角朊细胞和成纤维细胞增殖实验表明，ELP-KGF融合蛋白仍保留了KGF和弹性蛋白的性能［20］。Phan等［21］将ELP与两种禽流感H5N1抗原进行融合表达，结果显示ELP作为融合标签不仅增强H5N1抗原表达，且可以利用ELP纯化目标蛋白；此外纯化的ELP融合靶蛋白仍保留生物学活性。Verma等［22］将游离药物阿霉素（Dox）与ELP融合表达，结果表明游离Dox和合成的短肽Dox具有相似的生长抑制百分比；同时ELP无细胞毒性且不改变Dox对BMG-1脑胶质瘤细胞系的功能活性。Heidari-Japelaghi等［23］将人干扰素-γ（Human interferon-γ，hIFN-γ）和ELP融合得到融合蛋白，获得了高纯度和高产量hIFNγ-ELP，hIFN-γ-ELP可溶性增加，三轮ITC纯化可将hIFN-γ-ELP的总纯度提高到98.5%。同样，他们报道ELP与hIFN-γ融合，在烟草植株中瞬时表达。ELP融合可溶性增加，三轮ITC纯化后hIFN-γ-ELP的总纯度提高到98.2%。体外活性测定表明ELP对hIFN-γ折叠和生物活性没有干扰作用［24］。Wang等［25］将IFN分别和ELP标签和His结合，与IFNα-His不同，IFNα-ELP和ELP-IFN在20℃下主要表达为可溶性蛋白。

3.2 增加蛋白稳定性

提高蛋白的稳定性主要包括提高酶的热稳定性、化学稳定性、抵御酶失活和延长酶的半衰期。

3.2.1 增加蛋白热和化学稳定性 ELP融合蛋白可以增加蛋白的稳定性。为了增强蛋白质对变性剂和氧化剂的抗性与稳定性，生物高聚物可以与酶融合以保护它们不被分解，同时在较长时间内保持其分子完整性。Liu等［1］将胶原样多肽（Collagen like protein，CLP）与ELP融合，再分别与超氧化物歧化酶（Superoxde dismutase，SOD）和D-氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）融合，结果表明SOD-CLP-ELP和DAAO-CLP-ELP对尿素变性的抗性高于SOD和DAAO，H2O2对SOD-CLP-ELP和DAAO-CLP-ELP二级结构的侵扰作用明显减弱。ELP不仅能与水分子形成氢键，还可以与其他ELP分子形成氢键［18］。ELP序列重复的越长，所含的氢键越多，这解释了ELP融合蛋白热稳定性。Cho等［18］推测，与结构形成相关的氢键而非疏水性是稳定ELP坍塌的关键因素。最近，我们构建并表达了β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，β-glu）和ELP融合蛋白（Glu-ELP-His，GEH），结果表明ELP标签不影响β-glu的酶活、二级结构及动力学参数，同时显著提高了β-glu的热稳定性和对变性剂（尿素）的抗性，表明ELP在高温下形成的有组织的可逆粒子会限制共价连接的酶的运动，从而防止酶在高温下形成不可逆聚集［26］。与不含ELP的酶相比，ELP融合酶对变性剂具有更高的稳定性，表明变性剂与蛋白质中的氨基酸竞争形成氢键，而不是稳定蛋白质的蛋白质内氢键［26］。酶的固定化也可以提高酶的稳定性，我们的研究进一步表明GEH的热稳定性相似于固定化β-glu［27］。

3.2.2 提高药物的代谢稳定性 ELP融合蛋白可提高药物代谢稳定性，延长药物的半衰期，增加药物在组织内的停留时间，实现长效以减少给药频率［28］。Udo等［29］研究表明，ELP与治疗性蛋白质的融合比非ELP融合蛋白具有更长的血清半衰期。Hu等［30］报道ELP融合干扰素（Interferon alpha，IFN-α）可以增加IFN-α的循环半衰期、药物代谢动力学和抗肿瘤效果。Huang等［31］构建肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）与ELP融合蛋白RGD-TRAIL-ELP，结果表明RGD-TRAIL-ELP的诱导凋亡能力是RGD-TRAIL的3倍，延长TRAIL循环半衰期，且对肝脏无显著毒性。Sarangthem等［32］描述IL-4受体靶向肽（IL-4 receptor targeting peptide，AP1）与ELP聚合物融合结合增强肿瘤的积累和保留时间以及药物偶联物的稳定性和抗肿瘤活性。将胰高血糖素样肽-1（Ghcagons-like pepfide 1，GLP1）融合到ELP中，在体内形成可生物降解的凝胶状“贮库”从而缓慢释放药物，葡萄糖的控制可持续长达数周［33］。Wang等［25］将IFN分别和ELP标签和His结合，与游离IFN相比，IFNα-ELP和ELP-IFN血浆稳定性显着提高。Strohl等［34］证明ELP序列与小的治疗蛋白的融合可使这些蛋白质具有较大的水动力半径，提高它们的半衰期。

4 ELP在生物工程上的应用

4.1 ELP在蛋白纯化方面的应用

在不影响蛋白功能的情况下，通过离子强度或温度来增强ELP融合蛋白聚集的能力分离纯化目标蛋白。通过构建ELP融合蛋白，可逆的相变循环可以用于分离纯化质粒或酶。第一步是通过基因工程设计构建ELP与靶蛋白的融合蛋白，建立ELP融合蛋白体系；之后通过简单的过滤或离心，可逆的相变循环纯化融合蛋白。ELP融合蛋白的相变通常是通过加热或加盐来实现的；弃上清后，将ELP沉淀在预冷缓冲液中重新溶解，在相变温度下重新溶解后ELP再次离心，上清液为含有目标蛋白的溶液。与目前常规色谱技术相比较，ELP具有纯化成本低、操作简单（只需要离心机）、不影响酶活性且可以增加酶稳定性等优点。

ELP与靶蛋白基因水平的融合使融合蛋白与ELP具有相同的刺激反应行为。Kang等［35］通过不同链长的ELP纯化左聚蔗糖酶，结果表明，采用ELP的热相变特性可以成功纯化融合蛋白，与ELP融合后酶的活性保持不变。Meyer等［36］通过ELP融合标签的相变特性纯化硫氧还原蛋白，ITC纯化的硫氧还原蛋白纯度优于组氨酸标记的亲和层析。Floss等［37］将ELP融合与结核分枝杆菌抗原Ag85B/ESAT-6（Tuberculosis Ag85B/ESAT-6，TBAg）融合，结果表明通过ELP的相变特性成功纯化TBAg-ELP，且融合蛋白在ELP标签的存在下，在转基因烟草植物中的表达与游离TBAg相比有所增加。因为ELP融合蛋白系统非常稳定，已用于烟草等植物表达系统的表达和纯化，同时也主要用于纯化大肠杆菌中产生的融合蛋白，从而形成了一套完整的带有ELP标签的重组蛋白质的ITC分离纯化体系［38］。

ELP标记的α-淀粉酶（α-amylase）与ELP融合构建了融合蛋白ELP-amy，在E.coli表达，比较ITC纯化与非色谱（固相金属亲和色谱）。结果表明发现ITC的纯化产率与His标签纯化产率相当，且ELP标签改善热稳定性和催化效率［39］。这与我们的研究结果相似：ITC纯化效率相似于His标签的镍柱纯化效率，且ELP标签不影响β-glu的动力学参数，二级结构及酶活，显著提高酶的稳定性［26］。Wang等［25］也报道了将IFN分别和ELP标签和His融合，结果表明ELP融合蛋白纯化效率与His融合蛋白纯化效率相当。

4.2 ELP在组织工程方面的应用

ELP是一种高度可定制的组织工程用途的支架聚合物，由于ELP来源于细胞外基质（Extracellular matrix，ECM），非常适合向细胞和组织提供生物学相关的功能及类似ECM的环境［40-41］。此外，ELP是一种基因编码的生物聚合物，在基因水平上控制相关参数，如链长、位置、设计、类型、组成、聚合物结构和交联位点的数量［41］。同时，ELP被注射到需要移植的组织缺陷部位后可以连接一个生物相容性较好的交联剂，使交联复合物在温度或者其他的诱导条件下形成具有良好机械性能的支架，使ELP溶液与细胞或者其他的生物活性物质很好地交联在一起，同时具有很好的生物相容性。此外，在ELP的重组合成过程中可将生物活性多肽嵌入ELP内或附加到ELP末端，ELP重组蛋白可通过体内的蛋白酶裂解肽进行降解，同时支架的降解速度也可以根据VPGXG进行调整［42］。

Zhang等［43］以温度为29℃的ELP作为培养表面，在这些基质上培养羊膜上皮细胞和间充质细胞，结果表明该方法可制备多层细胞片。在体外ELPs聚合物培养的软骨细胞和成体干细胞中，软骨基质不断合成并能保持一定的形状一段时间，这表明ELPs可提供合适的物理生化环境以促进软骨细胞分化，支持软骨基质的合成，并作为软骨修复的细胞外支架［44］。Atefyekta等［45］将抗菌肽（RRP9W4N）共价结合含有细胞粘附肽域（Cell-adhesive peptide domains，RGD）的ELP表面涂层。该涂层具有很高的抗菌作用，同时对人体细胞没有影响，表明将AMPs共价结合到含RGD的ELP上是医疗器械抗菌涂层的极佳选择。Bandiera等［46］将一种新的双功能重组蛋白人类弹性蛋白样多肽（Human elastin-like polypeptide，HELP）和胆红素结合蛋白UnaG的融合产物HELP-UnaG。该工程产品除了提供蛋白质生产的高产方法外，HELP还能创建功能性的固态3D矩阵，在完整培养基中直接检测在细胞水平产生的胆红素。

4.3 ELP在药物载体方面的应用

精确控制ELP的序列、大小和刺激反应特性，为合理设计用于药物传递的大分子载体提供平台；ELP也可以设计成自组装的纳米级构建体，在生理条件下作为组装的纳米粒循环结构［47］，也可能触发对外界温度刺激的自组装反应［48］。ELP的温度响应行为也可使用在因为生理温度引起的粘性凝聚层局部递送治疗剂，ELP库可以释放肽类ELP融合物、蛋白质-ELP或其他化学非肽类药物。在37-42℃之间ELP采用调节Tt作用于体外热疗以及药物的传递治疗实体瘤。温度高于Tt时ELP会发生可逆转化，形成不溶性聚集体细胞，通过胞吞而内化，轻度热疗可使肿瘤部位血流量和血管通透性增加，促进药物进入肿瘤部位［49］。

作为药物载体，ELP在注射部位不会引起炎症，对小鼠成纤维细胞无毒，不产生皮肤刺激性、溶血性、全身毒性和全身抗原性。Park等［50］在低温敏感脂质体（Low temperature-sensitive liposomes，LTSLs）中发现一种脂肪酸结合的具有生物相容性和高热敏性的ELP，通过与半衰期为1 h的LTSLs相比，该方法制备的ELP-TSL在固体肿瘤中通过EPR积累可获得5 h的血浆半衰期。Dragojevic等［51］将Dox与细胞穿膜多肽（Cell penetrating peptide，CPP）和ELP融合，构建CPP-ELP-Dox融合蛋白，该蛋白在生理温度下可溶，在外部施加温和温热时聚集在肿瘤部位。Kuna等［52］进一步研究ELP的大小和形状如何影响其药代动力学和生物分布，建立大小从25-110 kD不等ELP库。结果表明血浆终末半衰期与聚合物大小成正比，器官的生物分布也与大小有关。肾脏累积了所有大小的最高ELP水平，其次是肝脏。Lee等［53］构建含有整合素刺激RGD配体（Integrin-stimulatory RGD ligands）的ELP融合蛋白（人工基质多肽），与未处理的胰岛相比，该人工基质多肽包覆的胰岛在移植前培养中显示出更高的生存力和胰岛素分泌能力，经该人工基质处理的胰岛在肾移植小鼠维持血糖正常的时间比对照更长。最近，Ryu等［54］通过ELP融合dnMAML多肽，利用被动靶向和热活性肿瘤靶向技术，dnMAML肽被有效地递送至肿瘤组织，抑制肿瘤生长。

4.4 ELP在水凝胶方面的应用

由于ELP复单元序列中的客座残基可以是任何氨基酸，所以改进ELP序列的空间十分宽广。如用赖氨酸或者丙氨酸取代客座残基，可在ELP链中插入一个活性位点，用如交联或者肽段功能化等化学修饰，使交联后的ELP可以形成了凝胶和薄膜［55］。ELP基水凝胶是最近的工程改造的构建体已经在生物医学中使用，编码到其骨架中的独特生物活性导致细胞粘附的增加，促进血管生成因子的释放增强和随后的内皮细胞组织［56］。

此外ELP水凝胶还表现出色的生物相容性、非免疫原性、最佳的生物力学特性以及对不同刺激的反应能力。Flora等［57］将VEGF模拟肽（QK肽）通过化学方法结合到ELR的水凝胶中并注射入小鼠的后肢区域，可增强构建物中新的毛细血管的形成，体内发现在QK水凝胶中获得了功能性微脉管系统，为细胞存活和组织生长提供了促血管生成的环境，体外确认软骨基质的形成II型胶原蛋白但不存在I型胶原蛋白，提示透明软骨形成。Paiva Dos Santos等［58］将Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）序列融合到ELP中，构建ELP-IKVAV和ELP-VKAIV，然后使这两种融合蛋白与官能的聚乙二醇（PEG）反应形成水凝胶；结果表明比IKVAV序列的水凝胶上生长的神经元的神经突更长。这种功能化的ELP-IKVAV生物材料对神经化的组织工程显示出有趣的特性有巨大的应用价值。

4.5 ELP的新兴应用

ELP在材料化学、糖化合物、抗菌涂层、纳米复合材料、眼表面支架、生物成像和生物马达等在许多新兴领域也得到广泛应用。

Malho等［59］利用聚丙烯酸（Polyacrylic acid，PAA）和ELP合成具有温度敏感性和pH敏感性多功能纤维素纳米晶体（Cellulose nanocrystals，CNCs），为CNCs应用提供了更多的可能。Ghosh等［60］将ELP与钌聚吡啶基（Ruthenium（II）polypyridyl）复合物偶联，研究临界转变温度以下和以上两个相的所得共轭物的光物理性质，为利用温度控制生物聚合物的刺激响应特性提供可能性。Xiao等［61］将多糖与刺激反应性ELP结合制备热敏性自组装复合物，将溶液温度提高到特定转变温度Tt后，所得的生物共轭物能够自组装成水溶液中定义明确的纳米颗粒，为用于生物医学应用的受生物启发的刺激反应性自组装提供了新颖的途径。Wang等［62］将罗丹明（Rhodamine）标记ELP用来测试隐形眼镜温度相关性，结果表明ELP凝聚显著调节了释放曲线，保留了80%以上负载量，半衰期可达到4个月，非凝聚条件下仅为1-4 d。

Geng等［63］2018年设计了一个富含组氨酸的弹性蛋白样多肽（HRELP）融合标签，在E.coli中高效表达，SDS-PAGE后几分钟内用保利试剂（Pauly’s reagent）特异性染色，利用pH位移介导ITC可以纯化HRELPs和HRELP20-BMP2融合蛋白，表明所建立的HRELP可以作为一种多功能蛋白标记物，可以Pauly染色快速检测，并通过pH触发的ITC简单纯化。Joachim等［64］将昆虫金属蛋白酶抑制剂（Insect metalloproteinase inhibitor，IMPI）与ELP融合以促进产物的回收，通过搅拌器和曝气级联的补料分批工艺，以控制溶解氧，表明自聚合ELP标签通过上游生产和下游加工的集成简化整个流程。

Chen等［65］通过结合荧光分子来监测ELP热转变，将诱导发光分子四苯乙烯衍生物TPE-COOH通过酰胺键与ELP结合形成ELP-TPE。由于ELP-TPE具有荧光强度高，水溶性好和出色的生物相容性等优点，因此在生物成像方面具有巨大的潜力。Diehl等［66］使用ELP偶联物来控制和探测生物马达组件中的协同作用，设计一个多马达模型系统，其中单体驱动蛋白-1（Kinesin-1）马达锚定在人工蛋白质支架上。ELP被插入支架内基本亮氨酸拉链结构域之间，而互补酸性拉链与kinesin-1融合，这种设计可精确控制电动机的空间和弹性耦合。

5 ELP的发展方向及亟待解决的关键问题和技术

5.1 高效切除ELP标签

近年来ITC技术研究领域又有新的研究成果，常规ITC技术需要化学反应或蛋白酶去除ELP标签，Chilkoti［67］、Wood［4，68］和Chen［69］实验室分别构建在靶基因C段融合内含肽intein，能够快速从靶蛋白中去除ELP标签，然后通过另一个热沉淀循环将其去除，这种方法避免昂贵的蛋白酶，简化去除ELP过程。Stiborova等［70］利用化学修饰方法把能特异可逆结合靶蛋白的捕捉分子连接到ELP上，在细胞裂解液中，这种可循环利用的ELP-捕捉分子能选择性地结合靶蛋白，后续接着常规ITC分离程序就能从细胞裂解液中分离出靶蛋白。除此之外，当复合蛋白溶液中ELP融合蛋白浓度在1 μm/L以下，向溶液中额外加入一些ELP单体分子来提高靶蛋白的分离纯化效率。这是因为ELP热相变特性与浓度相关，蛋白溶液中ELP总浓度越高，ELP融合蛋白发生相变时分子间疏水作用越强，沉淀效率就越高［17］。

5.2 开发乙醇/盐诱导ELP沉淀

ELP提供了一种高效且高度可扩展的途径，需要添加摩尔水平的盐来沉淀，难以控制最终产物的盐度。规避高盐蛋白溶液问题的一种方法是利用在水/乙醇溶剂中的ELP溶解度。Mills等［71］开发乙醇诱导的ELP沉淀、纯化和脱盐带有ELP标签的蛋白，经过一个周期的氯化钠诱导沉淀，随后一个周期的乙醇诱导沉淀，获得了具有高纯度和低盐度的最终蛋白质产物。这种选择性沉淀和脱盐ELP标签蛋白质的新方法将能够对需要严格控制缓冲液条件的蛋白质材料进行高通量筛选。

5.3 开发可应用的短ELP

短ELP由于其较高的逆转变温度而很少使用。将短ELP与形成三螺旋的胶原样肽结合而成功克服了这一障碍。短至4个五肽基序，由此产生的弹性蛋白样肽-胶原蛋白样肽（ELP-CLP）生物缀合物意外地自组装成纳米级血小板，可能是通过形成双层结构［72］。正如前面所述单个VPGVG单元可以充当热力学独立单元，进行温度诱导的扩展β-转弯转变。Cao等［6］将ELP的β-转角单引入两亲性肽来开发温度响应性自组装分子，开发出一种新型的自组装肽。此类肽的自组装行为受整体分子疏水性，电荷分布和温度的影响，具有较高疏水性的分子表现出更好的自组装能力，以形成长的纤维状纳米结构。

5.4 丝弹性蛋白样多肽（Silk-elastin-like polypeptides，SELP）

SELP由ELP和丝绸样多肽（Silk-like polypeptides）构成。SELP是仿生序列，具有重复基序（GAGAGS）n。SELP被广泛应用在药物传递和组织工程中。SELP通常被设计为基本单元［（GAGAGS）n-（VPGXG）m］。SELP自组装由丝绸或两个组分驱动，产生各种纳米结构，包括纳米颗粒、纳米纤维、纳米凝胶和水凝胶。与ELP相似，替换SELP中的X可以解决pH、离子强度、氧化还原、酶促刺激和电场带来的新的动态刺激响应功能［73］。药物被包裹在由丝状嵌段制成的疏水核中，将载有药物的SELP纳米颗粒内化到HeLa细胞中，并将DOX传递到细胞核中。纳米粒子显示出与游离药物不同的传递途径，且在体外对癌细胞具有增强的毒性，表明对于耐药性癌细胞模型是一种有效传递方法［74］。

5.5 ELP应用亟待解决的关键问题和技术

尽管ELP在蛋白纯化及药物载体等方面显示出巨大应用前景，但是还有以下问题值得进一步研究。（1）选择恰当的极性和疏水性客座氨基酸X，优化出不同客座氨基酸残基的排序和数量，筛选出最佳五肽重复序列单元；（2）ELP作为药物载体虽然具有安全性，然而ELP在体内的降解途径和机理尚未有详细研究；（3）如何提高ELP药物材料的智能性，开发温控、盐控和pH控ELP药物；（4）能够有效控制ELP自组装过程及自组装形成纳米颗粒的直径大小；（5）作为药物载体，提高ELP药物靶向性，使其更加高效、特异识别靶向组织或细胞。中的应用越来越受到关注。此外，ELP已被融合到来源于丝、胶原、树脂和卷曲线圈的各种自组装蛋白质/肽中。复杂的自组装具有来自不同块组件的组合物理化学特性系统已经被构建。例如，由于定位效应，与单一结构域的ELP相比，ELP-胶原融合具有意想不到的低Tt的协同效应。精确控制ELP的设计有利于操纵它们对外界环境的刺激反应和其他物理功能特征，同时ELP可调的理化性质、良好的生物相容性和独特的机械/生物特性使ELP在生物学上具有广泛的应用。

6 总结

大规模纯化蛋白是分离纯化目标蛋白关键，然而如何快速、高效地从宿主细胞中分离纯化重组蛋白一直没有好办法。目前，亲和层析法是重组蛋白分离纯化的主要方法，该纯化技术操作繁琐，需要特定的试剂及设备，难以大规模运用。使用ELP标签的ITC法是一种超相分离行为，可以触发超相分离行为获得高纯度蛋白，使得融合蛋白的简单分离纯化成为可能。通过ITC纯化可以提高大部分重组蛋白的溶解度、稳定性和活性。在大肠杆菌中表达的融合蛋白具有良好的可逆溶解性，该方法可重复使用以提高ELP融合蛋白的纯度。

近年来，由于生物聚合物ELP及其衍生分子具有良好的弹性、生物活性、长期稳定性和自组装性，其在水凝胶、组织工程、生物医学和药物传递系统