小檗碱干预脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞MH-S分泌NO、IL-6等炎性介质的机制研究

孙 垚 朱 欢 张 跃 (南京医科大学附属儿童医院，南京 210008)

肺泡巨噬细胞存在于肺泡内，是肺部巨噬细胞的主要种类，在正常生理环境下，其主要作用是清除组织内细胞碎片或无害抗原[1]。在肺组织受到致病微生物侵袭或者损伤时，肺泡巨噬细胞会启动强烈的促炎反应以维持组织稳态，但过度的炎性反应往往会加重组织损伤，从而诱发各种肺部疾病[2]。目前针对肺部炎症反应的治疗药物主要分为抗生素和糖皮质激素两类，前者以清除致病菌为主，后者以消除炎症为主[3-5]。然而，抗生素的过度使用极易出现耐药性，激素类药物又容易出现不良反应[6,7]。因此，寻求新的抗炎药物对于肺部炎症疾病乃至其他类炎症相关疾病的治疗具有重大意义。

小檗碱(Berberine，BBR)主要存在于毛茛目毛茛科、小檗科、防己科及罂粟科植物中，此外在芸香科植物中也有较多分布，是一种具有广泛药理活性的生物碱类成分[8]。研究表明，小檗碱有很强的抗炎抑菌作用，其能通过对NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ)信号等通路的调节，影响免疫细胞之间的平衡，抑制炎症因子的分泌和表达、减轻组织损伤等多种作用途径来减轻或抑制炎症的产生与发展[9-12]。目前有关小檗碱体外抗炎作用机制的研究主要集中在单核细胞(THP-1)或腹腔巨噬细胞(RAW264.7)等，本文旨在研究小檗碱对LPS诱导小鼠肺泡巨噬细胞分泌炎性介质的影响及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1材料 小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S购自美国ATCC；BBR购自成都普瑞法科技开发有限公司，HPLC纯度≥98%；RPMI1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)、MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]购自美国Sigma公司；TRIzon总RNA提取试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；iTaqTMUniversal SYBR Green supermix购自美国BIO-RAD公司；5×All in one RT-MasterMix购自上海斯信生物科技有限公司；一氧化氮(NO)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；小鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-1及IL-12 ELISA试剂盒购自南京翼飞雪生物科技有限公司；一抗诱导性一氧化氮合酶(iNOS)、Toll样受体4(TLR4)、髓样分化因子(MyD88)、白介素1受体关联激酶4(IRAK-4)、核转录因子κB(NF-κB)、β肌动蛋白(β-actin)及二抗HRP标记羊抗兔IgG(H+L)购自沈阳万类生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 MH-S细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期时，将细胞接种于96孔板或6孔板中继续培养。

1.2.2MTT法检测小檗碱对MH-S细胞活力的影响 取对数生长期的细胞，接种于96孔板中，每孔约1×104个细胞，接种6 h后，加入终浓度为0、1、5、10 μmol/L的小檗碱。培养6、12、18、24 h后弃去培养基，每孔加入MTT溶液(0.5 mg/ml)100 μl继续培养4 h后弃去培养基，每孔加入100 μl二甲基亚砜，充分溶解反应产物后，于490 nm处测定各孔吸光度值，计算不同浓度小檗碱对细胞生长活力的影响。

1.2.3Western blot法检测小檗碱对LPS诱导MH-S细胞相关蛋白表达的影响 取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，每孔约2×105个细胞，接种6 h后，除空白对照孔外，每孔加入终浓度为0.5 μg/ml的LPS溶液。设置模型孔(含LPS，不含小檗碱)，其他每孔分别加入1、2、5 μmol/L的小檗碱，继续培养24 h后，用无菌管收集细胞上清液，进行细胞因子的检测。细胞用预冷的PBS洗涤2次后，每孔加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的细胞裂解液100～150 μl，裂解后将细胞小心刮下离心取上清，BCA法检测细胞蛋白的浓度。调整蛋白浓度，取相同总量的蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜。转膜后用4%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST清洗后加入一抗于4℃孵育过夜，TBST清洗后加入二抗于室温孵育2 h，TBST清洗后进行化学发光、显影、定影。采用Image Pro-Plus 6.0软件分析电泳条带灰度值，以目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.4RT-PCR检测小檗碱对LPS诱导MH-S细胞炎症因子的影响 按照1.2.2中方法进行MH-S细胞的接板、给药。给药48 h后，弃去上清液，用预冷的无菌PBS缓冲液洗涤2次，加入TRIzon总RNA提取试剂提取RNA。RNA逆转录参照逆转录试剂盒说明书将试剂混匀，放入逆转录仪器中进行转录。逆转录所得产物直接进行荧光定量PCR，参照试剂盒说明书在专用低位PCR反应孔板中加入相关反应物，引物序列见表1，参照试剂盒说明书所列程序进行反应。以β-actin做内参，所得结果将原始值进行2-ΔΔCt转换后进行统计学处理。

1.2.5细胞上清液NO、炎症因子的含量检测 按照相关试剂盒所附说明书的操作，绘制标准曲线，分别计算各细胞因子的含量。

2 结果

2.1小檗碱对MH-S细胞活力的影响 结果如图1所示，小檗碱在1、5 μmol/L的浓度作用24 h，对MH-S细胞的生长活力几乎没有影响；在10 μmol/L的浓度下，能明显降低MH-S细胞的活力，在作用超过12 h开始具有统计学意义(P<0.05)，呈一定的时效性。因此，小檗碱的给药浓度最大不能超过 5 μmol/L。

2.2小檗碱对LPS刺激MH-S细胞炎症因子的影响 结果如图2所示，0.5 μg/ml的LPS作用MH-S细胞24 h后，细胞上清液中NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的含量明显升高(P<0.01)。给予不同浓度的小檗碱刺激后，NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的水平有不同程度地下降，并呈一定的量效关系。

图1 小檗碱作用不同时间对MH-S细胞活力的影响Fig.1 Effect of berberine on viability of MH-S cells at different timesNote:Compared with the 0 μmol/L group,*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3小檗碱对LPS刺激MH-S细胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12 mRNA的影响 结果如图3所示，0.5 μg/ml 的LPS作用MH-S细胞24 h后，细胞中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等炎症因子mRNA的表达量明显升高(P<0.01)。给予不同浓度的小檗碱刺激后，NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12的mRNA水平呈浓度依赖性地下调，并在剂量为5 μmol/L时，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

2.4小檗碱对LPS刺激MH-S细胞中iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65的影响 结果见表2和图4，0.5 μg/ml的LPS作用MH-S细胞24 h后，细胞iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白表达量明显升高(P<0.01)。给予5 μmol/L的小檗碱刺激后，MH-S细胞iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白表达量显著下调(P<0.05)。

表1 引物序列
Tab.1 Sequences of primers for real-time PCR

NameForward(5′→3′)Reverse(5′→3′)Product(bp)TNF-αCCTGTAGCCCACGTCGTAGGGGAGTAGACAAGGTACAACCC148IL-6CTGCAAGAGACTTCCATCCAGAGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG131IL-1GAAATGCCACCTTTTGACAGTGTGGATGCTCTCATCAGGACAG116IL-12CTGTGCCTTGGTAGCATCTATGGCAGAGTCTCGCCATTATGATTC169β-actinGGCTGTATTCCCCTCCATCGCCAGTTGGTAACAATGCCATGT154

图2 小檗碱对MH-S中NO(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)、IL-1(D)及IL-12(E)表达量的影响Fig.2 Effect of berberine on expression of NO(A),TNF-α(B),IL-6(C),IL-1(D) and IL-12(E) in MH-S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+,BBR-),*.P<0.05,**.P<0.01.

GroupsiNOSTLR4MyD88IRAK-4NF-κBp65Control0.28±0.132)0.66±0.112)0.49±0.082)0.35±0.052)0.84±0.072)Model2.01±0.162.47±0.422.73±0.171.89±0.102.19±0.24BBR1.27±0.162)1.56±0.181)1.30±0.102)0.84±0.072)1.28±0.171)

Note：Compared with the Model group,1)P<0.05,2)P<0.01.

图3 小檗碱对MH-S中TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12 mRNA的影响Fig.3 Effect of berberine on mRNA level of TNF-α,IL-6,IL-1 and IL-12 in MH-S cellsNote:Compared with the Model group(LPS+，BBR-),*.P<0.05,**.P<0.01.

图4 小檗碱对LPS刺激MH-S细胞中iNOS、TLR4、MyD88、IRAK-4及NF-κB p65蛋白的影响Fig.4 Effect of berberine on expression of iNOS,TLR4,MyD88,IRAK-4 and NF-κB p65 in MH-S cells induced by LPS

3 讨论

巨噬细胞是吞噬细胞的一种，是机体抵抗外来病原体侵袭的重要组成部分，其主要功能是对细胞碎片及病原体进行吞噬作用，激活免疫细胞并引起炎症反应。肺泡巨噬细胞长期存在于肺泡内，是肺部巨噬细胞的主要种类，是宿主抵御外部侵袭的第一道防线，在维持肺部免疫系统稳态过程中发挥关键作用[13]。在肺部受到外来或内在致病因素刺激后，肺泡巨噬细胞被激活并释放大量炎性介质如细胞因子、趋化因子、补体、危险信号分子等[14]。其中趋化因子能继续招募单核细胞和中性粒细胞，或作为刺激剂激活肺上皮细胞和间质巨噬细胞，从而建立肺部炎症微环境[15]。在炎性环境下，巨噬细胞表面Toll样受体表达增加，刺激多种炎症因子的激活、表达、释放。研究表明，肺泡巨噬细胞的活化与多种肺部疾病相关，包括急性肺损伤、慢性阻塞性肺病、支气管哮喘、肺纤维化等[16-20]。

巨噬细胞在受到LPS等刺激下，会活化并释放大量炎症分子或因子，包括NO、TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等[21]。NO由iNOS催化合成，在LPS的刺激下，巨噬细胞大量合成并释放NO，在杀伤病原体的同时对周围正常细胞也造成损害[22]。TNF-α是由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，其作用于细胞表面时，与细胞膜表面受体结合后能形成复体，从而激活下游的一系列蛋白激酶，进而激活NF-κB和JNK信号通路，参与机体的炎症反应和免疫调节等病理过程[23]。IL-6、IL-1及IL-12均属白介素家族，主要由巨噬细胞、小胶质细胞、淋巴细胞及上皮细胞等产生。在正常生理条件下含量极低，在病理状态下如COPD、肺损伤，该类白介素含量急剧升高。IL-6能够介导炎症反应，促进T细胞和B细胞的增生和分化，参与免疫调节，引起免疫性病理损伤[24]。IL-1是参与炎症反应的最重要的细胞因子之一，能诱导出与TNF-α相似的生理和代谢改变，并能与TNF-α产生相互协同作用[25]。IL-12作为一种重要的免疫调节因子，具有多种生理功能，其一方面能促进巨噬细胞产生一氧化氮合酶，释放活性氮，增强吞噬功能和局部炎症反应；另一方面能促进Th1型细胞分化，抑制Th2型细胞分化，促进IL-2、TNF-α等细胞因子的产生[26]。

小檗碱是一种季铵类型的生物碱，常用于治疗各种炎症疾病及细菌感染。药理研究发现，小檗碱能改善细胞内脂滴的聚集和氧化应激，从而改善棕榈酸钠诱导的细胞凋亡[27]；并能通过抑制抗原诱导的Lyn、Syk和Gab2的磷酸化，从而抑制下游MAPK通路，在过敏反应的体内模型中，小檗碱的使用通过上述途径抑制小鼠的被动皮肤过敏反应[28]。但有关小檗碱对肺泡巨噬细胞活化影响的相关研究较少，本文研究结果表明，小檗碱能够明显抑制LPS刺激的巨噬细胞活化，降低NO的分泌量，同时剂量依赖性地在蛋白层面及基因层面下调TNF-α、IL-6、IL-1及IL-12等炎症因子的含量，具有显著的抗炎作用。

Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)是一类天然免疫受体，在自然界动物体内广泛分布，主要表达于巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞等免疫细胞表面。TLRs能够直接识别并结合病原体或其产物，引发一系列信号转导，进而导致炎性介质的释放[29]。TLR4是人类发现的首个TLRs蛋白，其与相应配体结合后，能进一步激活NF-κB，从而促进各种炎性因子基因表达的激活。由LPS激活的TLR4/NF-κB信号通路主要分为MyD88依赖的信号通路及MyD88非依赖的信号通路。在细胞表面，TLR4与LPS结合后发生聚合将信号转导至胞内，与MyD88的羧基端结合，同时MyD88的氨基端与IRAK-4结合，并激活TRAF-6，进而激活IKKs复合物，NF-κB抑制物在IKKs复合物的作用下发生磷酸化并降解，使得NF-κB激活并转入细胞核内诱导细胞因子IL-1、IL-6及IL-12等的表达[30-32]。本实验研究结果发现，小檗碱能够通过抑制iNOS的活性，减少NO的释放，另一方面通过抑制TLR4/MyD88/IRAK-4通路的活化，进而抑制NF-κB的激活，从而减少炎症介质的释放。