TNFSF14对STZ诱发Ⅰ型糖尿病的影响及其机制初探①

江 沛 李 由 徐 砜 许桂莲 李桂清 ( 陆军军医大学西南医院肾科,重庆 400038)

Ⅰ型糖尿病 (type 1 diabetes mellitus，T1DM) 是一种自身免疫性疾病，它是由机体对自身抗原的免疫反应不当而引起的，它由活化的T细胞损伤自体胰岛中的β细胞，使之不能正常分泌胰岛素，导致胰岛素的绝对缺乏[1,2]。

TNFSF14是肿瘤坏死因子超家族(tumor necrosis factor super-family,TNFSF )中的一员,又称LIGHT或 HVEM-L，其可由树突状细胞、巨噬细胞、NKT等多种细胞产生[2]。TNFSF14含有 254个氨基酸，既可为膜结合型分子，又可作为可溶性分子，主要通过与 LTβR(TNFRSF3)和 HVEM(TNFRSF14)两种受体结合，在肿瘤免疫、炎症反应、自身免疫性疾病的发生及胸腺阴性选择等过程中发挥重要的生物学作用[3]。TNFSF14缺陷小鼠 (TNFSF14 konckout，TNFSF14 KO小鼠) 具有正常的外周淋巴器官，它通过对免疫细胞的影响或通过参与炎症过程在调节宿主免疫应答中起着重要的作用[4]。

链脲佐菌素(streptozotocin,STZ) 是一种DNA烷基化试剂，能通过GLUT2葡萄糖转运蛋白独自进入细胞，对胰岛中的β-细胞具有毒性，根据剂量的不同常用于诱导实验动物的各型糖尿病模型[5,6]。

鉴于TNFSF14与其受体HVEM和LTβR对于机体免疫具有重要的调节作用，而目前尚未有文献阐述其对Ⅰ型糖尿病进程的影响。因此，本文以STZ诱导的T1DM小鼠为模型，探讨TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中发挥的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1材料、试剂 STZ (Sigma) ；柠檬酸(国药集团)；柠檬酸钠(国药集团)；血糖仪(强生稳豪)；苏木素-伊红染色液(碧云天)；FITC标记的抗小鼠CD3、PE标记的抗小鼠CD4以及APC标记的抗小鼠FoxP3流式抗体均购自Biolegend公司。

1.1.2实验动物 23～25 g体重雄性SPF级C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司；TNFSF14 KO小鼠(C57BL/6背景)为德国Kfeffer博士惠赠，在动物房洁净层柜(IVC系统)内饲养，恒温、恒湿条件下自由摄食饮水[2]。

1.2方法

1.2.1Ⅰ型糖尿病小鼠模型的建立 C57BL/6小鼠按照55 mg/kg的剂量，腹腔注射STZ，连续注射5 d，根据血糖变化情况每周测量2～3次血糖，直至趋势稳定为止[5,6]。

1.2.1.1pH=4.5的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液的配制 柠檬酸(FW:210.14) 2.1 g加入双蒸水100 ml 中配成A液 柠檬酸钠 (FW:294.10) 2.94 g加入双蒸水100 ml中配成B液用时将A、B液按1.2∶1混合，pH计测定pH值,调节pH=4.2～4.5，即是所需配置STZ的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。

1.2.1.2含1% STZ 的0.1 mol/L柠檬酸缓冲液的配制 用0.1 mol/L柠檬酸缓冲液配制浓度为1%的STZ，即是1 ml 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中溶解0.01 g(10 mg)STZ。

1.2.1.3注射剂量的计算 按照小鼠体重20 g 、剂量55 mg/kg计算，需要体积为100 μl的含1% STZ 的 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液。

1.2.1.4注射前的准备 第一次注射前应禁食4 h，称量禁食后体重。注射时用柠檬酸缓冲液溶解STZ，放在冰上，锡箔纸避光，按空腹体重注射相应的STZ，并在30 min内注射完毕，因为STZ的水溶液极不稳定[2,7,8]。

1.2.1.5模型建立成功的验证 C57BL/6作为STZ的敏感型动物，从第五次注射后的当天开始取尾静脉血测血糖，直到连续2 d血糖超过13.89认为模型建立成功[7,8]。

1.2.1.6实验标本的获取 STZ最后一次注射23 d后，脱颈处死小鼠，取出胰腺、脾脏及胰腺淋巴结，将胰腺用4% 多聚甲醛溶液固定；脾脏及胰腺淋巴结置于200目筛网上研磨，红裂液裂解红细胞，50 ml PBS洗涤2次，5 ml PBS重悬，制成单细胞悬液。

1.2.2HE染色及评分 取固定好的胰腺，石蜡包埋并连续切片，做苏木素-伊红(HE)染色。采用双盲法在光镜下随机观察每只小鼠胰腺HE染色后的3～5个胰岛并评分，评分标准按照炎症浸润的程度进行量化评价：0分，无炎症细胞浸润；1分，浸润百分比<25%；2分，浸润百分比25%～50%；3分，浸润百分比>50%。

1.2.3流式细胞术 检测两组小鼠脾脏和胰腺淋巴结细胞中的细胞亚群(CD3+T细胞、CD4+T细胞以及CD4+FoxP3+调节性T细胞)的百分比。将脾脏和胰腺淋巴结制备成单细胞悬液，然后进行染色：加入FITC-CD3、PE-CD4和APC-FoxP3抗体，避光、冰上孵育25 min，流式洗液洗涤2次。流式细胞仪(BD FACS CantoⅡ)检测各亚群的百分率。

2 结果

2.1TNFSF14 缺陷显著下调STZ诱导的Ⅰ型糖尿病的发生 在最后一次注射STZ后，我们通过监测血糖发现TNFSF14 KO 小鼠的血糖整体升高缓慢，相比之下，WT组升高迅猛，在处死小鼠前已经全部超过正常血糖值(图1，虚线为血糖临界值)。HE结果可以看出，TNFSF14 KO组的胰岛清晰可见，结构完整，而WT组中胰岛被大量破坏，并且有大量炎症细胞浸润(图2A、B)。提示TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理发生中起关键作用。

2.2与WT组相比，TNFSF14 KO小鼠脾脏和胰腺淋巴结淋巴细胞中CD3+T细胞的百分比明显下调 前面的结果已经证明TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的进程当中发挥关键作用，为进一步探讨其介导Ⅰ型糖尿病的机制，我们采用流式细胞术检测两组小鼠脾脏和胰腺淋巴结中CD3+T细胞和CD4+T的百分比。结果表明，TNFSF14 KO组脾脏及胰腺淋巴结中的CD3+T细胞明显高于WT组(P<0.05)(图3A)，而CD4+T细胞百分比无显著差异(图3B)。

图2 HE检测WT和TNFSF14 KO小鼠的胰腺病理变化及评分Fig.2 Pathological changes and scores of pancreas in WT and TNFSF14 KO mice were detected by HE stainingNote: A.HE Staining (×400).n=5 cells/ground；B.Score of pathological changes in the pancreas tissue.*.P<0.05.

图4 WT和TNFSF14 KO小鼠脾脏及胰腺淋巴结淋巴细胞中CD4+FoxP3+调节性T细胞亚群的百分比Fig.4 Percentage of CD4+FoxP3+regulatory T cell subsets in spleen and pancreas lymph nodes of WT and TNFSF14 KO miceNote: SP.Spleen；pLN.Pancreatic lymph node.*.P<0.05,**.P<0.01.

2.3与WT组相比，TNFSF14 KO小鼠脾脏和胰腺淋巴结淋巴细胞中的CD4+FoxP3+调节性T细胞的百分比显著升高 已有的文献表明调节性T细胞是一群抑制性T细胞，它积极抑制免疫系统的激活，防止发生病理性的自我反应[9,10]，我们的结果表明，TNFSF14 KO组小鼠脾脏及胰腺淋巴结淋巴细胞中的CD4+FoxP3+调节性T细胞百分比显著高于WT组小鼠(P<0.05)(图4A、B)。

3 讨论

Ⅰ型糖尿病，是一种胰岛素绝对缺乏的糖尿病，它的病因涉及遗传和环境因素的结合[11]，潜在的机制包括胰腺中产生胰岛素的β细胞的自身免疫破坏[12]。目前还没有预防Ⅰ型糖尿病的方法，如果不及时治疗，糖尿病会引起许多并发症，严重影响患者的生活质量，甚至危及生命。据估计，每年约有8万名儿童患上这种疾病。

本文以STZ腹腔注射小鼠诱导Ⅰ型糖尿病为模型，探讨TNFSF14在Ⅰ型糖尿病中的作用。结果表明注射STZ于WT小鼠后，血糖持续升高，在23 d后全组小鼠的血糖都超过了正常值，而TNFSF14 KO组小鼠的血糖上升显著减缓，提示TNFSF14通路在Ⅰ型糖尿病的进程当中发挥重要作用。

为了进一步确定TNFSF14是如何参与Ⅰ型糖尿病的进程，我们流式细胞术检测了经STZ诱导后的两组小鼠的脾脏和胰腺淋巴结中细胞亚群的百分比。结果表明，TNFSF14 KO组脾脏及胰腺淋巴结中的CD4+FoxP3+调节性T细胞百分比均显著低于WT组(P<0.05)。

免疫系统有一个重要功能就是能够区分自我和非我，当自我/非我识别失败时，免疫系统就会破坏自身的细胞和组织，从而导致自身免疫性疾病[13]。调节性T细胞积极抑制免疫系统的激活，防止病理自我反应，即自身免疫疾病。CD4+FoxP3+调节性T细胞是免疫抑制性的，抑制或下调效应T细胞的诱导和增殖[14]，由此我们推测TNFSF14通过下调调节性T细胞的分化来介导Ⅰ型糖尿病的发生，其具体的分子机制需进一步探讨。

综上所述，我们的研究结果表明，TNFSF14在Ⅰ型糖尿病的病理发生中发挥重要作用，其可能通过抑制CD4+FoxP3+调节性T细胞的分化来介导Ⅰ型糖尿病的发生。