荧光定量PCR快速检测在病毒性角膜炎诊疗中的应用

秦力维，廖强华，石 芊，彭秀军，曹利群，高 原，郭建巍，陈昌国，陈秋圆，马志家

角膜病变是眼科第三大致盲性疾病，其中病毒性角膜炎是临床常见的一类眼疾[1]。近年来，随着广谱抗生素和皮质类固醇激素的广泛及不合理使用，该病发病率呈上升趋势。由于疱疹病毒可长期潜伏在宿主体内并反复发作，角膜病变由浅至深，反复迁延，严重者可造成角膜白斑，使视力明显下降甚至失明，加强对病毒性角膜炎的诊疗具有重要意义。作者对临床诊断为病毒性角膜炎的患者泪液或角膜上皮细胞，用荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR)方法进行了检测，根据检测结果指导临床调整治疗方案，现将结果分析总结如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2016年1月—2018年12月在中国人民解放军总医院第六医学中心就诊临床诊断为病毒性角膜炎、未用过任何抗病毒药物、征询患者同意愿意接受病原检测的门诊及住院患者共90例，其中男性44例(48.9%)，女性46例(51.1%)，性别差异无统计学意义(χ2=2.8，P=0.17)。患者年龄20～80(46±12)岁。90例患者中首次发病就诊患者38例，反复多次发作后就诊患者52例。

1.2 临床检查及眼部分泌物的采集 用裂隙灯显微镜检查患者的眼睑、结膜、角膜、前房、虹膜、晶状体情况。在未进行抗病毒药物治疗前用一次性塑料滴管吸取患者结膜囊内的分泌物约0.5 mL，对角膜病变比较深的患者用无菌刀片刮取角膜上皮细胞于含有0.5 mL生理盐水的无菌试管中送检。

1.3 病毒性角膜炎的诊断

1.3.1 病史 入组患者，发病时间1 d至数日，发病次数有首次也有反复多次发作，有感冒、劳累、过度用眼、外伤等诱因伴随，部分患者有自滴消炎眼液、眼膏治疗病史，但均未使用过任何抗病毒药物治疗。

1.3.2 症状 单眼或双眼视力下降、畏光、流泪、眼红、眼痛、异物感、眼睑浮肿及分泌物增多等。

1.3.3 体征 结膜囊水样及粘性分泌物增多，结膜充血，睫状充血，角膜水肿，角膜呈各种类型病变：浅层点状、树枝状、假树枝状、广泛糜烂性上皮浸润；水肿；上皮下浸润；角膜基质灰白色不规则浸润；上皮及基质荧光素染色阳性；角膜内皮皱褶；角膜后沉积物；角膜云翳或斑翳形成；角膜知觉减退；耳前淋巴结肿大等。

1.3.4 辅助检查 角膜刮片、普通细菌及真菌培养。

1.4 仪器与试剂 单纯疱疹病毒(herpessimplex virus,HSV)1型、HSV2、水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)和EB病毒(EB virus,EBV)荧光定量检测试剂盒均购自中山大学达安基因股份有限公司，其中包括Taq聚合酶、PCR反应液(反应液中含有5种病毒的特异性荧光探针)、dNTP等；FQ-PCR仪为美国ABI公司7500。判定标准以核酸检测水平大于1 000拷贝/mL为阳性。

1.5 实验方法

1.5.1 核酸提取 取100 μL中加入50 μL DNA裂解液，振荡混匀，100 ℃金属浴 10 min，13 000 r/min离心5 min，上清液即为DNA模板。

1.5.2 FQ-PCR反应 用AXYGEN8联排PCR管，依次加入反应液40 μL，Taq聚合酶3 μL，核酸模板2 μL，振荡均匀后瞬时离心15 s。PCR反应条件为93 ℃ 2 min 93 ℃45 s，55 ℃ 60 s，10个循环；93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s 40个循环；收集荧光。

2 结果

2.1 病毒性角膜炎诊断和病毒核酸检出情况 共收集临床诊断为病毒性角膜炎患者90例，其中上皮型49例(54.4%)，基质型41例(45.6%)。上皮型患者中，女性26例(53.1%)，男性23例(46.9%)；基质型患者中，女性20例(48.7%)，男性21例(51.3%)。

90例病毒性角膜炎患者中有54例检测出疱疹病毒核酸，检出率为60%;首次检出36例，多次检出18例，首次发病和多次发病患者的病毒核酸检出率差异比较具有统计学意义(χ2=31.2,P<0.001)。表1。

表1 首次发病与多次发病检出率比较[n(%)]

49例上皮型疱疹性角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为30.6%，41例基质型病毒性角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为95.1%，上皮型角膜炎和基质型角膜炎患者的疱疹病毒核酸检出率差异比较具有统计学意义(χ2=11.64,P<0.001)。表2。

表2 上皮型角膜炎与基质型角膜炎疱疹病毒核酸检出率的比较[n(%)]

2.2 首次发作就诊患者中疱疹病毒核酸的检出情况 发病后首次就诊的38名患者中有36人检测出疱疹病毒核酸，检出率为94.7%，检出前3位的病毒依次为HSV1(23例)、EBV(6例)和HSV2(3例)。

2.3 多次发作后就诊患者中疱疹病毒核酸的检出情况 多次发作后就诊的52名患者中有18名检测出疱疹病毒核酸，检出率为34.6%，主要的感染病毒为HSV1(13例)和HCMV(3例)。

2.4 不同类型的角膜炎中疱疹病毒核酸的检出情况 90名病毒性角膜炎患者中HSV占病毒检出数的74.0%，基质型角膜炎中HSV1、EBV、HCMV、HSV2 4种病毒检出率均高于上皮型角膜炎(图1)。

图1 不同类型的角膜炎中疱疹病毒核酸的检出情况

上皮型角膜炎中病毒检出率和平均拷贝数HSV1(11/15，3.6×105)明显高于HSV2(1/15，1.2×104)、EBV(1/15，6.1×103)、HCMV(1/15，3.2×103)和VZV(1/15，1.9×103)。

基质型角膜炎中病毒检出率和平均拷贝数HSV1(25/39，5.7×105)明显高于HSV2(3/39，3.8×104)、EBV(6/39，3.7×103)、HCMV(4/39，2.9×103)和VZV(1/39，1.7×103)。

3 讨论

病毒性角膜炎可发生于任何年龄，多为单眼发病。诊断主要依据为反复发作的病史和眼部的临床表现,由于技术和条件的限制，在相当长的时期内，实验室无法为临床提供精准的病原学检测项目。随着分子生物学技术的发展，现在可以用FQ-PCR快速检测病毒性角膜炎患者眼部泪液及病变区角膜上皮细胞中5种病毒核酸，该方法特异性强、快速简便，临床医生在检测2 h后即可获得检测结果，避免了患者的等待时间，通过实验可定量检测出临床分泌物标本中的5种疱疹病毒,检测结果及病毒拷贝数为第1次的抗病毒治疗提供了科学依据，医生可以根据病毒类型和病毒拷贝数调整药物剂量，为病毒性角膜炎的早期诊断、精准治疗和治疗过程中的动态检测及疗效评价提供了科学依据。

临床常见的疱疹病毒感染主要有：人单纯病毒性角膜炎、疱疹病毒引起的急性滤泡性结角膜炎、色素膜炎(包括急性视网膜坏死)和视网膜炎等。引起人病毒性角膜炎的疱疹病毒主要包括HSV1、HSV2、VZV、HCMV和EBV 5种。其中单纯疱疹病毒性角膜炎发病率和致盲率均居角膜病首位，发病率有不断增高的趋势，是我国主要的致盲性眼病之一，占角膜盲的首位。我们研究结果显示，90例病毒性角膜炎中，疱疹病毒核酸的检出率为60.0%，5种疱疹病毒中HSV占病毒检出数的74.0%，研究结果与文献相一致[2]。

EBV为人类4型疱疹病毒，在宿主细胞内主要以潜伏和裂解2种形式存在[3]。90.0%以上成年人体内EBV抗体阳性，可保护机体避免再次感染同种病毒[4-5]。在机体抵抗力下降时，潜伏在静息B淋巴细胞中的EBV重新活化，导致多种严重疾病的发生。本研究共发现8例由EBV引起的病毒性角膜炎，在所有患者的外周血单个核细胞中都检测到了EBV核酸，血浆中均未检出EBV核酸，可能与EBV的慢性潜伏和机体抵抗力下降有关。

HCMV是导致免疫力低下个体感染的重要病原体。人类感染HCMV后多表现为无症状潜伏感染，HCMV活化状态与机体免疫系统的下降密切相关[6]。机体一旦感染HCMV，将长期或终身携带。本研究中共检测到4例由HCMV引起的角膜炎，均为哺乳期女性，经进一步深入研究，在对应患者的乳汁和尿液中也均检测到了HCMV，主要是由于哺乳期女性免疫力下降，自身交叉感染所致。所有男性患者样本中均未检测到HCMV。

VZV是一种致神经性疾病的人类疱疹病毒，通常在儿童身上引起水痘，水痘病愈后病毒长期潜伏于脑神经节、背根神经节等神经轴内。当人体免疫力下降时，潜伏的VZV被重新激活，经感觉神经纤维轴突下行至所支配的皮肤区，增殖后引起带状疱疹，本研究中共检测到2例由VZV引起的病毒性角膜炎，2例患者在发病3个月内均有带状疱疹病史，病毒性角膜炎主要是由于对带状疱疹治疗不彻底、机体免疫力降低，疱疹病毒液感染角膜所致。

基质型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率为95.1%，高于上皮型角膜炎中疱疹病毒核酸的检出率(30.6%)，并且基质型角膜炎中HSV1、EBV、HSV2、HCMV 4种病毒检出率均高于上皮型角膜炎，说明基质型角膜炎中因病毒复制量大，浸润角膜基质深层，病原检出率高，建议在临床治疗中对基质型疱疹病毒角膜炎要加大抗病毒药物的剂量和使用频率，并辅助其他药物治疗，必要时使用左氧氟沙星滴眼液以防治细菌性角膜炎的发生。

临床上治疗病毒性角膜炎的方法很多。我们根据病毒的检出情况和疾病分型进行个体化的精准治疗。对上皮型的角膜炎我们先使用阿昔洛韦滴眼液滴双眼，3/d，配合小牛血去蛋白提取物眼用凝胶，3/d。由于更昔洛韦生物利用度高，半衰期长达8 h，进入病毒感染细胞的速度快，在细胞中存留时间长，因此，本研究选用更昔洛韦进行基质型角膜炎的抗病毒治疗。实践证明，更昔洛韦眼用凝胶治疗基质型角膜炎比阿昔洛韦滴眼液疗效好，在角膜组织内停留时间长，渗透性高，对深层组织的角膜炎、角膜溃疡治疗效果要更快更深入，对病原学检测中病毒拷贝量大侵害角膜组织深的角膜炎一定要足量使用，由于考虑抗病毒药物本身对角膜的毒性作用，角膜营养保护类药物也要同时使用。同时对于溃疡侵及深基质层的患者除给予抗病毒治疗外，还给予免疫抑制剂环孢素和左氧氟沙星滴眼液。环孢素主要是选择性地抑制辅助淋巴细胞，治疗病毒性角膜基质炎局部应用环孢素比皮质类固醇更有效[7]，局部应用环孢素能抑制疱疹性角膜炎的复发[8]，使用左氧氟沙星滴眼液也是考虑到患者局部免疫防疫能力低下，防治细菌性角膜炎。对严重感染者还需要进行阿昔洛韦全身的抗病毒治疗。

研究结果显示引起病毒性角膜炎的病原体除了常见的HSV1外，HSV2、EBV、HCMV和VZV感染均可以引起病毒性角膜炎。发病后首次就诊的病毒性角膜炎患者中疱疹病毒核酸的检出率为94.7%，明显高于多次发作后就诊的患者(检出率为34.6%)，可能是首次发病患者感染局部病毒的复制比多次发病患者更为活跃。90例病毒性角膜炎患者中有54例检测出疱疹病毒核酸，检出率为60.0%。导致临床诊断和实验室诊断不一致的原因可能与患者感染病毒性角膜炎后就医的及时性、临床医生取样的精准性、病程的长短、病毒的多样性、病毒复制所处的时期和病毒潜伏的状态等因素有关。建议临床诊断为病毒性角膜炎的患者应尽早使用FQ-PCR进行5种疱疹病毒核酸的检测,并在急性期尽快使用抗病毒药物,以阻止病毒复制,以免患者抵抗力下降合并细菌和真菌感染。

特别指出的是，上皮型和基质型角膜炎中HSV的检出率和拷贝数明显高于其他病毒检出率和拷贝数。对HSV感染的患者要加大抗病毒药物的剂量和适当延长治疗周期，治疗过程中定期进行病毒核酸检测,以指导临床用药，连续3次检测阴性可停用抗病毒药物。

研究结果还提示，病毒性角膜炎的发生与疱疹病毒的全身感染密切相关，有些患者并无全身感染的迹象，但在外周血单个核细胞中发现了潜伏的病毒，这对感染者疱疹病毒相关疾病的防控提出了新的要求，值得相关学科医生的关注，也值得进一步深入研究。