榄香烯抗肿瘤作用机制研究进展

王乔宇，赵志刚

（1.首都医科大学附属北京天坛医院药学部，北京 100070；2.首都医科大学药学院临床药学系，北京 100069）

榄香烯（elemene）是从天然中草药姜科植物温莪术（温郁金）中提取的萜烯类化合物，具有广谱的抗肿瘤作用，同时与紫杉醇、喜树碱、长春碱、靛玉红、高三尖杉酯等被列入重要的植物源抗肿瘤药物名单[1]。榄香烯被发现具有抗肿瘤作用是基于我国医学工作者应用莪术油治疗宫颈癌取得的良好临床疗效，进一步研究证实，榄香烯是其抗肿瘤作用的主要物质基础。榄香烯乳注射液是由我国自行研制开发的抗肿瘤药物，1995年通过临床前研究和临床研究，作为国家2 类抗肿瘤新药成功上市。其主要成分为β-榄香烯，同时含有少量的γ-榄香烯和δ-榄香烯。以榄香烯为主要成分制备成不同剂型的还有榄香烯口服乳，服用方便。 多年来，大量的实验研究和临床实践进一步证实，榄香烯注射液具有抗瘤谱广泛、临床疗效确切、毒副作用小、可透过血脑屏障等特点[2-3]。目前，榄香烯注射液在临床上被广泛用于治疗恶性胸腹腔积液、多种实体瘤以及脑转移肿瘤。本文就榄香烯抗肿瘤作用机制研究进展进行综述，以期为其临床应用及深入开发提供参考。

1 直接抗肿瘤作用

榄香烯的抗癌谱较广，针对各类不同种类的肿瘤细胞均能表现出不同程度的抗肿瘤作用，且抗肿瘤机制涉及细胞增殖过程的多个方面。汤秀红等[4]研究发现，榄香烯能显著抑制人肺癌细胞株LAX、Anip-937、Spc-A1、A549、H128、SPC 生长。进一步研究显示，榄香烯对肿瘤细胞的DNA 及RNA 的合成均有一定抑制作用，且抑制效应与药物浓度呈剂量相关性。另有学者通过体外抗肿瘤活性实验发现，榄香烯乳注射液能显著抑制肝癌HepG2 细胞、结肠腺癌DLD-1 细胞、肺癌H292 细胞、宫颈癌HeLa 细胞、人原髓细胞白血病HL-60 细胞、胃腺癌SGC-7901 细胞及人乳腺癌MCF-7 细胞等肿瘤细胞株生长。而榄香烯浓度在低于400 μmol · L-1时对正常骨髓细胞增殖无显著影响[5]。高海德等[6]报道，榄香烯可使荷肝癌瘤株小鼠的肿瘤细胞呈现出不同程度的变性、坏死。陈亦明等[7]报道榄香烯具有显著抑制人胃癌SGC-7901 细胞株生长的作用，显微镜下观察发现经榄香烯处理后，肿瘤细胞胞质中空泡、颗粒增多，部分细胞漂浮、死亡，且肿瘤细胞数明显减少。何君等[8]制备了经叶酸修饰的榄香烯纳米脂质体，其在体外研究和荷瘤动物体内研究中均表现出对乳腺癌4T1 细胞高效的杀伤效果。目前还有研究证实，榄香烯对结肠癌、舌癌、卵巢癌、宫颈癌、食管癌、膀胱癌、前列腺癌、喉癌和黑色素瘤等肿瘤细胞均有较强的杀伤抑制作用。

1.1 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的一种主动死亡过程，在调控肿瘤细胞增殖以及肿瘤的形成和发展中起到关键作用。目前关于榄香烯乳注射液诱导细胞凋亡主要有以下几种路径。

1.1.1 阻滞细胞周期G1期为DNA 合成的前期，为DNA 合成提供物质基础；S 期为DNA 合成期，DNA 的复制与合成均在S 期进行。已有研究证实，榄香烯能够通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞增殖，可阻滞肿瘤细胞从S 期进入G2、M 期，以及细胞从G0、G1期进入S 期，从而降低细胞分裂增殖能力。研究表明，榄香烯可显著阻滞白血病HL-60 细胞进入S 期，减少进入G2/M 期细胞数，诱导细胞凋亡[9]。此外，榄香烯可使人肺癌A549 细胞停留在G0/G1期[10]。榄香烯对人骨髓瘤RPMI-8226 细胞具有显著抑制作用，处于G0/G1期的细胞比例显著升高，处于S、G2/M 期的细胞比例降低[11]。同时亦有榄香烯通过阻滞细胞周期减少细胞有丝分裂、抑制肿瘤生长的相关报道，如榄香烯可阻滞人肺癌NSCLC-H460 细胞、人黑色素瘤A375 细胞、人脑胶质瘤U251 细胞和U87MG 细胞、人卵巢癌A2780 细胞、人喉癌Hep-2 细胞从S 期进入G2/M期[12-14]。郭立峰等[15]发现，榄香烯能显著抑制脑胶质瘤SHG44 细胞的增殖，促进其凋亡，流式细胞仪检测结果显示，细胞凋亡指数随药物作用时间延长显著增加。榄香烯对人慢性髓系白血病K562 细胞生长具有明显抑制作用，呈量效和时效关系，不同浓度榄香烯均能使K562 细胞阻滞于G1期，G1期细胞百分比增加，S 期细胞百分比下降。

1.1.2 调控相关基因表达水平细胞凋亡是在基因调控下完成的自我消亡的过程，榄香烯对细胞凋亡的调控可能存在着多个调控点。研究发现，榄香烯诱导肿瘤凋亡的作用机制可能与癌症基因Bcl-2家族有关。其中抑制凋亡基因survivin、c-myc、核因子-κB（NF-κB）表达降低，促凋亡基因p21、p27、p53、bax等表达增强[16]。目前已有研究证实，榄香烯在诱导白血病细胞株K562 和HL-60、神经脑胶质瘤细胞U251 和C6、宫颈癌细胞HeLa、膀胱癌细胞BIU-87、乳腺癌细胞MCF-7、肝癌细胞株Hca-F25/CL-16A3、人黑色素瘤细胞株A375、肺癌细胞株A549和H460 以及喉癌细胞株Hep-2 细胞凋亡的同时，可下调Bcl-2基因的表达水平，从而促进细胞凋亡[17-19]。在肿瘤患者的疾病进展期，细胞周期蛋白D1（cyclinD1）往往会过表达，使肿瘤细胞加快进入S期，同时p16 蛋白则往往会受到抑制。p16 蛋白可与cyclinD1 竞争结合细胞周期蛋白依赖性激酶，抑制细胞增殖。因此cyclinD1基因往往被称为致癌基因，而p16往往被称为抑癌基因。刘剑等[20]研究发现，榄香烯可加速下调外周血淋巴细胞cyclinD1水平，而p16 蛋白下调的水平则会受到抑制。榄香烯可诱导黑色素瘤B16 细胞凋亡，作用机制是促使Bcl-2表达降低，抑癌基因p53表达增强。同时榄香烯能上调卵巢癌A2780 细胞中p21、p27、p53 蛋白的表达，使细胞周期阻滞于G2期[21]。

1.1.3 抑制端粒酶活性端粒酶是一种核糖蛋白体酶，由RNA 和蛋白质组成，能利用自身RNA 为模板合成端粒DNA，加入到真核细胞染色体末端，从而维持染色体稳定性[22]。端粒酶的活化是直接导致肿瘤细胞无限制生长的关键因素。在榄香烯诱导宫颈癌HeLa 细胞凋亡过程中，人类端粒酶催化亚单位（hTERT）基因转录表达受到明显抑制，从而降低了端粒酶的活性[23]。赵晓晓等[24]研究表明，榄香烯对人胃癌细胞株SGC-7901 有较强的细胞毒作用，且细胞分化程度越高，榄香烯对端粒酶活性抑制率也越高。另有学者研究表明，榄香烯能显著抑制K562 细胞的端粒酶活性，且抑制作用呈浓度、时间依赖性[25]。

1.1.4 促使细胞内Ca2+稳态失衡细胞内Ca2+水平相对稳定是维持细胞正常运转的基础，细胞中Ca2+浓度持续升高也是诱发细胞凋亡的主要因素。研究显示，榄香烯可促进人膀胱癌BIU-18 细胞内Ca2+释放，使细胞内Ca2+浓度升高，且细胞发生凋亡，提示调节细胞内Ca2+浓度异常可能是榄香烯诱导细胞凋亡的原因之一[26]。此外，榄香烯通过改变Ca2+浓度来诱导细胞凋亡在结肠癌LoVo 细胞[27]、肝癌HcaF细胞[28]中也得到了证实。

1.2 抗血管生成

血管生成在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移过程中起到了关键作用。血管不仅能为肿瘤提供营养和氧气，也是肿瘤细胞进入人体循环系统和发生转移的主要路径。因此，抑制血管生成、阻断肿瘤生长所需营养供应，从而达到抑制肿瘤持续生长和扩散的目的，是目前抗肿瘤药物研发的思路之一。研究表明，在兔角膜血管生成模型中，经眼球后及玻璃体腔注射榄香烯，视网膜组织的血管内皮生长因子（VEGF）明显降低，视网膜血管新生受到抑制[29]。同样，榄香烯也可以通过下调血管相关因子抑制肿瘤血管新生，研究人员通过免疫组化法检测了经不同浓度榄香烯处理的体外培养的人涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞株，结果显示，细胞内的VEGF 表达水平显著下降，提示这可能是榄香烯抑制肿瘤新生血管形成的机制之一[30]。此外，榄香烯可下调人肺腺癌细胞SPC-A-1 中VEGF-C 及VEGF-3 水平[31]。郭建忠等[32]使用榄香烯对体外培养的人脐静脉内皮细胞ECV-304进行干预，MTT 法检测结果显示ECV-304 细胞存活率明显降低。另有学者发现榄香烯可通过调控胃癌干细胞中靶基因NOTCH-1抑制肿瘤血管新生[33]。

2 诱导肿瘤细胞分化

恶性肿瘤在体内外诱导剂作用下向正常细胞分化方向逆转的现象被称为诱导分化。曲范杰等[34]在研究中发现，榄香烯具有诱导人胰腺癌细胞增殖分化的作用，同时可抑制胰腺癌细胞生长、促进其凋亡，且与剂量及时间呈正相关。另有研究发现，榄香烯对肺腺癌细胞具有诱导分化作用。胡守友等[35]研究发现，榄香烯可诱导小鼠黑色素瘤B16 细胞分化，使肿瘤细胞体积增大、细胞变长，多数分化的细胞表现出树突样结构，其原有的某些特性如侵袭转移、增殖失控也随之消失。

3 抑制肿瘤细胞侵袭和迁移

肿瘤细胞的运动和黏附能力与瘤细胞浸润和转移密切相关，术后肿瘤的复发、侵袭及转移也是影响癌症患者预后的关键因素。陈晓华等[36]研究证实，100 mg · L-1榄香烯作用于人食管鳞癌Eca-109 细胞48 h 后，与不含榄香烯的对照组相比能显著降低迁移细胞数（P＜ 0.05），提示榄香烯可抑制肿瘤细胞迁移。毛雨秋[37]研究发现，榄香烯可有效降低肝癌HepG-2 细胞的黏附能力，并抑制其侵袭及迁移。细胞-基质黏附实验结果显示，随着榄香烯浓度增加，HepG-2 细胞的黏附率明显降低；Transwell 小室迁移/侵袭实验结果显示，随着榄香烯浓度增加，HepG-2 细胞侵袭及迁移数量逐渐降低。榄香烯在体外抑制HepG2 细胞迁移、侵袭和黏附可能与其通过抑制NF-κB 与p65 活化从而抑制MMP-9 的表达有关。在人乳腺癌细胞研究中，Transwell 实验和划痕实验结果显示当榄香烯浓度达到10 mg · L-1时就能抑制高转移性细胞株MDA-MB-231 的侵袭和迁移能力[38]。

4 调节机体免疫功能

机体的免疫功能在抵御肿瘤过程中发挥着重要作用。榄香烯通过增强肿瘤细胞的免疫原性，多途径改善和提高机体的免疫功能，从而达到控制和杀伤肿瘤细胞的目的。已有研究证实，榄香烯能提高体外荷瘤小鼠T 淋巴细胞转化率，有效地促进其生成，从而起到提高机体免疫力的作用[39]。将榄香烯与巨噬细胞共孵育24 h 后，检测细胞表面主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ、MHC Ⅱ、CD40、CD86 分子表达和细胞吞噬情况，结果表明榄香烯可激活T 细胞，增强巨噬细胞的吞噬能力[40]。雷俊华等[41]报道了榄香烯联合化疗对晚期非小细胞肺癌患者的疗效，研究中58 例患者被随机分为单独化疗组（29 例）和联合用药组（29 例），结果显示，联合用药组患者外周血T 淋巴细胞亚群相关指标[CD4+T 细胞水平、CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比值及自然杀伤细胞（NK）水平]较单独化疗组明显升高（P＜ 0.05），CD8+T 细胞（也称抑制性T 细胞，往往与机体免疫抑制有关）较单独化疗组明显下降（P＜ 0.05）。以上免疫细胞水平的变化表明榄香烯可以改善肿瘤患者的免疫功能。袁琴等[42]报道了一项由76 例原发性肝癌患者参加、比较榄香烯联合化疗与单独化疗效果的研究结果，同样发现联合用药组患者外周血T 淋巴细胞亚群相关指标（CD4+T 细胞水平、CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比值及NK 水平）较单独化疗组明显升高，且可溶性白细胞介素-2 受体（SIL-2R）水平也显著下降（P＜ 0.05）。值得一提的是，联合用药组谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及总胆红素（TBIL）水平较治疗前均有显著下降（P＜ 0.01），提示联合使用榄香烯对肝功能具有一定的保护作用。

此外，有临床研究人员比较了化疗联合榄香烯与单独化疗在卵巢癌、消化道癌、肝癌等多种肿瘤引起的恶性腹水中的疗效，结果显示，化疗与榄香烯联用组与单独化疗组的有效率分别为85.00%和70.21%。经榄香烯治疗后，患者外周血中CD4+T 细胞显著增加、CD4+T 细胞/CD8+T 细胞比值增大，提示榄香烯在调节机体免疫功能方面有一定作用[43]。

5 提高耐药肿瘤细胞对化疗的敏感性

肿瘤细胞多药耐药的形成是肿瘤细胞免受药物攻击的最有效防御机制，也是导致临床化疗失败的主要因素。很多患者在经历多个周期的化疗后，开始会对化疗药物不敏感，因此，此时需要联合其他药物来增强对肿瘤的抑制效果。

Li 等[44]研究发现，将顺铂与榄香烯联合应用于膀胱癌细胞后，与单独使用顺铂的对照组相比，榄香烯可显著增强半胱氨酸蛋白酶（Caspase，包 括Caspase-3、-7、-8、-9、-10） 的 活 性， 而Caspase-3、-8、-9 正是调控细胞调亡过程的关键。榄香烯通过Caspase 依赖的细胞凋亡通路，触发人膀胱癌T-24 细胞凋亡，并促进顺铂诱导的细胞死亡，起到增强化疗效果的作用。Zhang 等[45]研究发现，10 mg · L-1榄香烯可以重塑已经对化疗药物抵抗的乳腺癌细胞的敏感性，通过RT-PCR 检测发现，榄香烯可上调雌激素受体mRNA 水平，其中肿瘤细胞的miRNA 中，miR-34a、miR-222、miR-452 和miR-29a 的表达均显著上升，使得肿瘤细胞对阿霉素、多西他赛的耐药得到逆转。Zhang 等[46]发现，耐阿霉素的乳腺癌细胞经过榄香烯处理后，其细胞膜上的P-糖蛋白（P-gp）明显降低。曾晖等[47]采用细胞培养及动物实验方法，研究了榄香烯逆转肺癌化疗耐药的作用。结果显示，与单独应用榄香烯、多柔比星相比，榄香烯与多柔比星联合使用能显著缩小肿瘤体积（P＜ 0.01），提示榄香烯可与化疗药物产生协同作用，增加化疗疗效。韦巧玲等[48]研究证实，榄香烯逆转肺癌化疗耐药作用机制是抑制P21基因表达，而与CDK8-P21 通路无关。陈琦等[49]报道，榄香烯可逆转肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）诱导的肺癌PC-9 细胞对吉非替尼的耐药，其机制可能与抑制HGF 活化的c-Met及其下游信号通路有关。在恶性脑胶质瘤细胞中进行的研究显示，榄香烯通过降低细胞外调节蛋白激酶（ERK1/2）的磷酸化水平及Bcl-2基因的表达，提高了肿瘤对替莫唑胺的敏感性[50]。Zhu 等[51]发现，榄香烯可增强人神经胶质瘤U87 细胞对化疗的敏感性，榄香烯可通过使胶质成熟因子β（GMF-β）依赖的ERK1/2-Bcl-2 信号通路失活来抑制U87 细胞的增殖。Jiang 等[52]报道，榄香烯对人肺癌A549 细胞有明显的放射增敏作用，其可能的机制是上调肿瘤细胞P53 水平和下调Bcl-2 表达水平。

6 结语

以β-，γ-，δ-榄香烯为主要成分的榄香烯乳注射液和口服乳是我国自主开发研制的抗肿瘤植物化学药，在多种实体瘤的治疗中临床疗效显著，应用前景广阔。在恶性肿瘤患者中进行的疗效评价研究进一步证实，榄香烯不同于传统的细胞毒性化疗药物，其在发挥直接抗肿瘤作用的同时，还具有增强机体免疫力、逆转耐药性、与放化疗协同增效等作用。临床的安全性评价表明，榄香烯毒副作用小，无骨髓抑制反应，不会引起明显的心、肝、肾功能损害。目前，榄香烯广谱抗肿瘤的作用靶点及通路尚未完全明确，且关于榄香烯抗肿瘤作用的研究大多为细胞与动物实验，临床研究数量不多。在后续研究中，应深入探索榄香烯针对不同瘤种的作用机制以及增强肿瘤对化疗药敏感性的机制，为减轻甚至逆转多药耐药提供思路，并设计出更多将榄香烯与其他药物联用的方案。