β-内酰胺类抗生素的检测及去除技术的研究进展

李家成,王佳豪,许锴,刘康乐,彭思伟,林子增,王郑

(南京林业大学 土木工程学院，江苏 南京 210037)

β-内酰胺类抗生素(Beta-lactam Antibiotics，BLAs)是一种种类很广的抗生素，在现有的抗生素种类中使用较为普遍，其中包含青霉素与头孢菌素等。BLAs是一种最持久的人为药物污染物，目前在许多水生环境中检测到[1-3]。环境中的抗生素主要来自于农用兽药、医用药物以及污水厂的处理水排放[4]。环境中抗生素的残留对人体和生态构成了潜在的威胁[5]，比如少数病人会对BLAs产生过敏反应、土壤中残留的抗生素会对植物根系生长和种子萌发产生影响等[6]。此外，因滥用BLAs等抗生素导致的抗性细菌(Antibiotic Resistant Bacteria，ARB)及抗性基因(Antibiotics Resistance Gene，ARG)的污染正威胁着人类的健康与生态的安全[7]。

1 样品前处理方法

检测样品前处理是首先从样品中分离出待测物质，然后采用合适的样品处理方法，使待测组分转变成仪器可测定的状态[8]。其主要作用是将药物从样品中提取出来，去除样品中所含的干扰杂质，从而是待测组分状态能够达到检测的要求[9]。由于环境中存在的抗生素含量较少，为了减少对环境样品中基质的影响，提高测定结果的正确性，故在样品分析前需做预处理[10]。下面介绍了几种内酰胺类抗生素检测前处理的方法：液液萃取[11-12]、固相萃取[13-14]、基质固相分散萃取[15-16]。

1.1 液液萃取

液-液萃取(Liquid-liquid Extraction，LLE)又称溶剂萃取，是利用组分在溶剂中的溶解度不同从而达到分离或提取的效果，或者通过控制pH值来调节药物在两相中的分配。

Moreno-González等[17]采用超高效液质联用技术，建立了一种新的多残留法测定婴儿乳和酸奶中15种BLAs的含量。采用Kinetex联苯核壳柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，水与0.05%乙酸和甲醇的流动相，在6 min内实现分离。采用多重反应监测模式，在ESI+中检测分析物，并对裂解条件进行优化，以获得最高的灵敏度。使用联苯键合柱可以获得所有研究分析物的满意选择性。提出了离子对盐析辅助液-液萃取作为样品处理方法，并通过实验设计进行了优化。在最佳条件下，加样回收率为79%～93%。定量限小于9.0 μg/kg，结果表明该方法具有快速简便，灵敏度高，适用性强等优点。分析时间、灵敏度和准确度的结果表明，该方法适用于不同婴儿食品中β-半乳聚糖残留量的监测。

1.2 固相萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是利用待测组分与干扰物在萃取剂上吸附力的强弱不同，从而实现两者的分离。常见的固相萃取剂是含C18、腈基等特殊填料的物质。

漆晴等[18]采用固相萃取/超高效液相色谱-串联质谱法，检测东太湖水源地三个典型点位原水中8类共31种抗生素的残留量(包括氨基糖苷类 1种、林可胺类1种、氯霉素类2种、β-内酰胺类 2种、大环内酯类4种、喹诺酮类4种、四环素类 4种、磺胺类13种)。通过固相萃取富集、多反应监测(Multiple Reaction Monitoring，MRM)定性定量分析，该方法的平均回收率为65.6%～108.8%，相对标准偏差(Relative Standard Deviations，RSDs)为2.35%～17.1%，准确度及精密度均良好，灵敏度高(最低检出浓度为1.0 ng/L)，可快速有效地检测东太湖原水中多种痕量抗生素的残留量。

任召珍等[19]采用固相萃取/高效液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中青霉素G、青霉素V等其它10种β-内酰胺类抗生素残留量,以青霉素G-D7 为内标。样品首先用磷酸盐缓冲溶液提取，然后用正己烷除提取液中所含的脂，处理后的样品再经PEP-2固相萃取柱净化，最后采用高效液相色谱-串联质谱对样品进行测定，内标法定量。在相应的浓度范围内，10种BLAs线性系数均大于0.99，检测限为0.25～2.0 μg/L。在低、中、高3个不同的浓度水平下，10种BLAs在不同基质中的回收率均处于80%～120%范围内，相对标准偏差小于10%。结果表明,该方法能够满足动物源食品中上述10种BLAs的测定需求。

1.3 基质固相分散萃取

基质固相分散萃取(Matrixsolid-phase Dispersion Extraction，MSPD)是一种快速样品检测处理技术。其原理是研磨固相萃取材料与样品的混合物，再将得到的物质作为填料装柱，淋洗柱子，洗脱待测物，从而实现待测物的分离和提取[20]。

Huang等[21]建立了一种基于基质固相分散(MSPD)的高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中15种BLAs的方法。肌肉组织与Oasis-HLB吸附剂混合，用正己烷清洗由吸附剂/肌肉组织基质制成的柱，然后用乙腈/水(50∶50,v/v)洗脱β-内酰胺，两者均含有0.1%甲酸。将最终提取液蒸发，重新配制成乙腈/水(10∶90,v/v)进行高效液相色谱-串联质谱法分析，各基质匹配校正曲线的相关系数(r2)均大于0.99。β-内酰胺类药物的检测限和定量限分别为0.02～0.63 μg/kg和0.07～0.97 μg/kg。在强化水平下，各检测物的平均回收率处于92%～111%范围内，相对标准偏差均小于12%。该方法准确、重复性好，已成功应用于中国市场猪肉中15种β-内酰胺类物质的检测。

2 内酰胺类抗生素的检测方法

目前，对于BLAs的检测方法主要有：毛细管电泳法、液相色谱法、液质联用法以及其他检测方法。

2.1 高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳(High Performance Capillary Electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。

Li等[22]首次合成了聚吡咯包被尼龙6纳米纤维膜作为固相膜吸附剂，用于城市河水中两种BLAs(苯唑西林和氯唑西林)的提取。然后用毛细管电泳二极管阵列检测器(Capillary Electrophoresis with a Diode Array Detector，CE-DAD)检测分析物。用扫描电镜和傅里叶变换红外光谱仪对合成的纳米纤维膜进行了表征。优化了实验条件，包括聚吡咯包被尼龙6纳米纤维膜用量、样品溶液pH值、吸附体积和解吸条件。在最佳提取分离条件下，苯唑西林和氯唑西林的检出限均为2.0 ng/mL。将该方法应用于城市河流水样中两种β-内酰胺的测定。两种BLAs的回收率在84.2%～96.4%，表明聚吡咯包被尼龙6纳米纤维膜对这两种抗生素具有较高的提取能力。日内测定的相对标准偏差为2.26%～5.29%，日间测定的相对标准偏差为2.38%～7.02%。

Li等[23]研究证实了聚吡咯作为吸附剂在Fe3O4磁性纳米粒子(PPy/Fe3O4MNPs)表面的应用。用透射电子显微镜、傅里叶变换红外吸收光谱仪和X射线衍射对合成的磁性复合材料进行了表征。选择4种β-内酰胺类药物[苯唑西林(Oxacillin，OXA)、氯唑西林(Cloxacillin，CLOX)、双氯唑西林(Dicloxacillin，DIC)和氟氯唑西林(Flucloxacillin，FLU)]作为实验分析物。采用胶束电动毛细管色谱-二极管阵列检测器(Micellar Electrokinetic capillary Chromatography-diode Array Detector，MEKC-DAD)对提取的β-内酰胺进行了测定。对影响萃取效率和分离度的关键参数进行了研究和优化。在最佳条件下，OXA、CLOX、FLU和DIC的检出限分别为1.0 μg/L和0.8 μg/L。校准曲线在2.5～200.0 μg/L范围内呈线性。该种方法主要用来测定水样中β-内酰胺类化合物，结果符合预期。日内相对标准差为1.09%～4.58%，日间相对标准差为2.95%～7.80%。实验结果表明，该方法具有灵敏、简便等优点，可用于测定水样中β-内酰胺类物质。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术，具有分离效率高、灵敏度高等优点[24]。

Briscoe S E等[25]建立了一种简便的高效液相色谱法，用于常规测定在200 μL人血浆中的10种BLAs的游离(未结合)浓度。测定的抗生素包含 3种头孢菌素(头孢曲松、头孢唑啉和头孢菌素)；两种碳青霉烯类抗生素(美罗培南和厄他培南)；5种青霉素(氨苄西林、哌拉西林、苄青霉素、氟氯唑西林和双氯唑西林)。有一种单一的普通样品制备方法，涉及超速离心和稳定化。色谱分析在Waters Xbridge C18柱上进行，根据分析物的不同，4个乙腈磷酸盐缓冲流动相之一，在210,260,304 nm处通过紫外吸光度检测感兴趣的峰。该方法已在危重病人治疗药物监测的病理实验室得到验证和应用。传统认为具有高蛋白结合的抗生素(如头孢曲松、头孢唑啉、厄他培南、氟氯唑西林和双氯唑西林)普遍存在的蛋白结合水平的显著变异性表明，该实验应优先用于药理学测定。治疗药物监测计划中BLAs的有效浓度。

2.3 液质联用法

液质联用(High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，HPLC-MS)又叫高效液相色谱-质谱联用技术，分别以液相色谱和质谱作为它的分离系统和检测系统。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，大大增强其分离能力，并且提高了其选择性和灵敏度。

王帅帅等[26]建立QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法与超高效液相色谱-串联质谱相结合同时测定羊奶中8种BLAs的检测方法。样品以乙腈作为提取试剂，用C18和PSA吸附剂进行净化，以0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈为流动相，反相C18色谱柱分离，正离子扫描，多反应监测模式进行质谱分析。结果表明，8种BLAs的线性关系良好，相关系数均大于0.986，样品加标回收率为83.8%～95.4%，相对标准偏差小于6.5%，方法检出限为0.25～1.00 μg/kg，定量限为1.0～2.0 μg/kg。该方法适用于羊奶及其它奶制品中BLAs的测定。

M Di Rocco等[27]建立了牛肌肉中30种BLAs残留量的测定方法。方法包括12种青霉素、12种头孢菌素、5种碳青霉烯类抗生素和法罗培南。首先采用乙腈-水(80∶20，v/v)和C18分散固相萃取(d-SPE)净化的简单溶剂萃取法提取样品，然后采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)检测。色谱在反相csh-C18柱上进行，采用二元梯度分离法，包括水中0.01%甲酸和0.2 mmol/L醋酸铵(流动相A)和乙腈中0.01%甲酸(流动相B)。质谱仪工作在正电喷雾电离模式。按照2002/657/EC指南进行验证。在重复性实验条件下，真实度在69%～143%，精确度在2.0%～29.9%。

2.4 其他检测方法

Merola G等[28]开发了一种用于青霉素G和其他BLAs的单用、简单、高灵敏的安培免疫传感器。研制的免疫传感器以过氧化氢安培电极为传感器，过氧化物酶为标记物。通过比较两种不同的竞争操作模式，验证了该免疫传感器优化方法的有效性。LOD为10-10mol/L，所研制的免疫传感器对所有BLAs的选择性较低，对其他非BLAs的选择性较高。Cámara M等[29]建立了同时测定β-内酰胺类抗生素(BLAs)、氨苄西林(Ampicillin，AMP)、青霉素G(penicillin G，PEG)、头孢氨苄(Cefalexin，CFX)、头孢唑林(Cefazolin，CFL)、头孢哌酮(Cefoperazone，CFP)、氯仿(Chloroform，CLO)的液相色谱-紫外二极管阵列检测方法。对色谱柱、流动相、温度和流速进行了优化，以提供这些分析物的最佳分辨率。抗生素残留物的提取方法包括使用乙腈对牛奶样品进行脱蛋白，然后离心，然后进行SPE清理。所研究的β-内酰胺类药物的回收率在79%～96%，相对标准偏差在0.5%～4.9%。Eltzov E等[30]研究提出了一种利用基因修饰细菌检测新型抗菌化合物的新方法。建立了不同的多重耐药(Multi-drug Resistant，MR)生物发光菌株，并将其暴露于不同的BLAs中。

3 BLAs的去除

3.1 吸附法

吸附法是利用多孔性的固体吸附剂吸收分离溶解性物质的一种技术，目的是为了达到物质的分离和富集，常分为物理吸附、化学吸附和离子交换吸附。吸附法具有高效、操作简单以及吸附剂可重复使用等优点。

孙玉茹[31]采用臭氧-活性炭组合工艺去除污水厂二级出水中的BLAs。实验选取6种常见BLAs作为目标抗生素，考察了臭氧投加量、反应时间、活性炭层高度以及空床停留时间(Empty Bed Contact Time，EBCT)对BLAs去除效果的影响。实验结果表明，在臭氧投加量为8 mg/L,臭氧与目标物质反应20 min,活性炭炭层高度设置为750 mm，EBCT为10 min的条件下，该组合工艺对BLAs的平均去除率达到了69.24%。实验结果表明,臭氧-活性炭组合工艺可以有效地去除二级出水中的BLAs。

Zhang等[32]研究了粉状活性炭对水中6种具有代表性的28种抗生素。研究结果表明，粉状活性炭对所选抗生素均有较好的吸附能力。在粉状活性炭用量为20 mg/L、接触时间为120 min的最佳条件下，去离子水和地表水的去除率分别为99.9%和99.6%，根据Freundlich模型的吸附等温线，不同抗生素对n的吸附量不同，且多数小于1。粉状活性炭是非线性的。抗生素的吸附符合伪二级动力学模型(R2=0.99)。用韦伯-莫里斯模型分析表明，粒子内扩散并不是唯一的速率控制步骤。总的来说，本研究的结果证实,粉状活性炭是一种可行的去除水中抗生素的方法，可以改善水质，控制抗生素污染。

卢通等[33]采用香樟叶作为实验原材料，在微波条件下利用尿素对香樟叶进行改性，目的是探究改性香樟叶对BLAs废水处理效果的影响。通过与普通香樟叶颗粒处理效果相比较，改性香樟叶颗粒处理该类废水效果显著，在投加0.500 0 g，温度 80 ℃，反应时间50 min，废水初始浓度0.480 0 g/L时，处理效果最佳。研究结果表明，在该条件下，废水中抗生素的去除率可达到72%，具有一定的应用价值。

3.2 氧化处理法

废水氧化处理法是利用强氧化剂尤其是羟基自由基来氧化分解废水中污染物，从而实现净化废水的一种方法，目前氧化法已成为处理生物难降解有机污染物的重要方法[34]。

Chen等[35]研究铁(Ⅲ)对BLAs降解的促进作用。研究结果表明，AMP降解速率常数随时间的增加呈线性增加，而当AMP浓度高于Fe(III)时，则与AMP浓度无关。中性pH最有利于铁(III)对AMP的促进降解，在实际地表水和废水基质中，也具有显著的促进降解作用。在各种BLAs中，Fe(III)促进青霉素降解的速度快于头孢菌素。Fe(III)促进降解可能是通过BLAs与羧基和叔氮络合，进而促进β-内酰胺环的水解裂解。本研究是首次发现Fe(III) 在BLAs降解中的作用并阐明其作用机制。

Karlesa Anggita等[36]研究了高铁酸盐水溶液氧化BLAs的反应动力学、反应部位、抗菌活性变化及转化产物。在pH为6.0～9.5范围内，测定了高铁酸盐(VI)与青霉素、头孢菌素和几种模型化合物反应的表观二级速率常数。高铁酸盐(VI)显示出对所选β-内酰胺的明显反应性。通过考虑高铁酸盐(VI)和β-内酰胺之间的物种特异性反应(反应发生在硫醚、胺和/或苯酚基团)，可以很好地解释pH依赖性。根据动力学结果，硫醚是氯唑西林和青霉素G的主要反应部位，除硫醚外，胺是氨苄西林和头孢氨苄的反应部位，胺和苯酚是阿莫西林的反应部位。HPLC/MS分析表明，β-内酰胺的硫醚转化为立体异构体(R)-和(S)-亚砜，再转化为磺基。高铁酸盐(VI)处理的β-内酰胺溶液的微生物定量分析表明，头孢氨苄氧化产生的转化产物表现出降低，但不可忽略的残余活性。对于其他β-内酰胺类化合物，转化产物的抗菌活性比母体化合物低(<5%)。总体而言，高铁酸盐(VI)氧化似乎是降低BLAs活性的有效方法，尽管可能需要其他方法来完全消除头孢菌素的活性。

Elmolla E S等[37]研究了photo-Fenton法降解水中抗生素阿莫西林、氨苄西林和氯唑西林的效果。考察了含104,105,103 mg/L阿莫西林、氨苄西林和氯唑西林的水溶液处理的最佳操作条件：H2O2/COD摩尔比1.5、H2O2/Fe2+摩尔比20和pH。在最佳操作条件下，阿莫西林、氨苄西林和氯唑西林在2 min内完全降解，生物降解性(BOD5/COD比)由0提高到0.4，COD和DOC在50 min内分别降解80.8%和58.4%。抗生素分子中有机碳和氮的酶和矿化。有机碳和氮矿化导致氨和硝酸盐浓度增加，DOC降解。DOC降解率提高到58.4%，氨氮从8～13.5 mg/L，硝酸盐在50 min内从0.3～14.2 mg/L。

3.3 生物降解法

生物法是通过利用微生物将有机物降解代谢为无机物的方法来处理废水。根据使用微生物的种类不同，可将分为好氧法、厌氧法和生物酶法等。

Huang等[38]使用180 L厌氧膜生物反应器(Anaerobic Membrane Bioreactor，AnMBR)运行 253 d 来处理实际的制药废水的工艺，这主要含有BLAs中的阿莫西林、头孢曲松钠、头孢哌酮和氨苄青霉素。工艺操作分为3个阶段，水力停留时间(Hydraulic Retention Time，HRT)分别为48,36,24 h，对应的平均有机负荷率(Organic Loading Rates，OLRs)和抗生素负荷率(Antibiotic Loading Rates，ALRs)分别从(2.37±0.28) kg增加到(4.46±0.87) kg COD/(m3·d)、从(19.06±0.67) g增加到(37.91±3.57) g BLAs/(m3·d)。阿莫西林、头孢曲松、头孢哌酮和氨苄西林的去除率最高，分别为(73.2±4.3)%,(47.7±2.2)%,(79.4±4.1)%,(34.6±3.3)%。实验结果表明，该工艺是一种切实可行、有效的处理含BLAs废水的工艺。

近年来，通过研究者的不断发现，将电化学氧化与生物处理相结合，能够加速反应底物的降解，实现工业废水的高效去除，呈现出良好的前景[39]。

4 总结

BLAs对于抗菌感染具有良好的效果，应用非常广泛，然而由于大量存在于环境中，对人和动物产生潜在的威胁。目前，国内外对于BLAs的萃取主要集中于SPE和MSDE等方法，这些方法具有灵敏度高、结果准确等优点，未来可能会趋向于对吸附剂和组合工艺的研究。检测方法主要是HPLC及其组合工艺，该类方法具有选择性高、分离能力强、高灵敏度的优点，未来的趋势仍然会是这些与其他工艺的组合。去除技术主要有吸附法、氧化法以及生物降解法，目前的研究表明，这些工艺对于BLAs的去除都具有很好的处理效果。随着传统工艺对抗生素不能有效的去除，高级氧化技术应用的越来越多，其中臭氧法和Fenton法较为常用，就目前几种方法而言，photo-Fenton法对BLAs的去除具有最好的效果。未来我们应当关注于组合工艺对BLAs的去除，充分结合工艺的优点，提高抗生素的去除效果。