水中磺胺类抗生素测定技术的研究进展

王佳豪,许锴,刘康乐,彭思伟,汤昱,罗程,史超,王子杰,林子增,王郑

(南京林业大学 土木工程学院，江苏 南京 210037)

抗生素(Antibiotic)自20世纪被发现以来，被广泛应用于动物疾病防治、畜牧及水产养殖和人类医疗等领域，时至今日，全世界已发现了4 000多种抗生素[1]。在复杂的环境基质中，水源水、饮用水以及城市污水系统中均能检测出以痕量形式残留的抗生素，工业废水造成的环境污染问题也越来越受关注[2],常规水处理工艺对制药废水中的抗生素残留去除效果有限，因此，残留于环境中的抗生素逐渐成为威胁人类健康的热点问题之一[3]。磺胺类抗生素(Sulfonamides,SAs)是目前使用最广泛，应用最多的抗菌药物之一[4]。由于SAs降解速度慢，会长时间残留于环境中，通过生物链的传递，在动植物和人体中长期积累，富集达到较高浓度，极大地威胁着人类的健康安全,因此加强对磺胺类药物残留的检测十分必要[5]。此外，抗生素的大量使用甚至滥用，其导致的抗性细菌(Antibiotics Resistance Bacteria,ARB)及抗性基因(Antibiotics Resistance Genes,ARG)的污染也同时给人类健康和生态安全带来不容忽视的安全隐患[6]，SAs长期排放和累积的残留物虽会在环境中发生一定程度的降解，但是其产生的抗性基因的传播与扩散引发科学家们的高度关注。值得一提的是，基因污染与传统的物化环境污染不同，它不仅不易消亡而且能自我复制传播，因此给控制和去除带来很大难度[7]。水环境是ARB和ARG传播扩散主要的介质，迄今为止研究人员已经在污水处理厂[8-9]、河流[10]、湖泊[11]、海洋[12]中均找寻到了ARG的踪迹，并对抗生素及其耐药性进行风险评估[13]。为了解水环境中SAs的污染现状，本文考察了对水中磺胺类抗生素的前处理和检测技术的研究进展，为相关研究提供参考借鉴。

1 前处理方法

1.1 液液萃取

液-液萃取(Liquid-liquid extraction，LLE)是最早应用的样品前处理技术。萃取原理是利用样品中不同组分在两种互不相溶液相中溶解度或分配系数的差异来达到分离、纯化和富集的目的。其优势主要在于操作简便，设备简单且成本低[14]。但是传统的液液萃取耗时较长，而且一般有二次污染。因此，学者们对其进行改进，逐渐发展出液相微萃取技术包括单滴微萃取(Single Drop Microextraction,SDME)、中空纤维微萃取(Hollow Fiber Microextractio,HFME)和分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)。对于水中SAs的检测样品前处理方法，学者们的研究偏向于DLLME，然而由于SAs多为极性化合物，易溶于水，而DLLME技术要求萃取溶剂相对密度高于水且不溶于水，故萃取效率并不理想。因此学者们对水中磺胺类抗生素的分散液液微萃取技术的研究主要还是与其他萃取技术相结合。Li等[15]建立了一种低密度溶剂型溶剂破乳分散液液微萃取与单滴微萃取相结合的液液液微萃取新模型。将萃取剂溶剂(辛醇)与分散剂溶剂(甲醇)的混合物注入水样，形成乳液进行预萃取，破乳剂溶剂选用乙腈，最后进行SDME反萃取。此方法避免了典型的DLLME和SDME中搅拌离心步骤，简化了操作，提高了萃取效率。实验在最优条件下4种磺胺类化合物检出限为0.22～1.92 μg/L，根据分析物线性范围为1.0～500到10～500 μg/L，相对标准差小于4.6%。Ebrahimpour等[16]采用在线离子对乳化液相微萃取水样中SAs，在阳离子表面活性剂形成离子对络合物之后，将SAs萃取到分散的有机萃取溶剂中，然后乳液通过在线过滤器分离。结果表明，在最优条件下，线性范围为0.3～100 μg/L，检出限为0.1～0.3 μg/L，相对标准差小于4.7%～5.8%，回收率41%～97%。该方法同样避免了DLLME的离心步骤，同时萃取过程使用到的有机溶剂少，是一种环境友好、安全、简便的萃取技术。

1.2 微波辅助萃取与超声波萃取

微波辅助萃取(Microwave-Assisted Extraction,MAE)最大的特点就是加热，而与常规加热方式不同的是其借助不同物质吸收微波的能力差异来使萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使被萃取物质转移到萃取剂中。而超声波萃取(Ultrasonic extraction,UE)是利用超声波效应减少目标组分与样品基体之间的作用力，达到加速萃取的目的。这两种技术都是萃取的物理辅助，有效强化了化学萃取，优点是绿色、节能和高效。近年来，学者们也将这两种技术逐渐应用于水中磺胺类抗生素的萃取。

宋颖等[17]采用微波辅助离子液体液液微萃取法提取了水中SAs并检测。在240 W的微波功率辐射下，磺胺被萃取到融化的离子液体中。在最佳实验条件下，该方法在2～400 μg/L内线性良好，相关系数大于0.999 5，检出限小于1.28 μg/L，加标回收率81.9%～111.0%，相对标准差小于11%，适用于环境水样中磺胺类抗生素的测定。Dimpe等[18]用微波辅助固相萃取法(MASPE)提取了水样中的磺胺甲恶唑(SMX)进行分析并采用废旧轮胎制备的活性炭为固相萃取吸附材料，增强吸附能力。该方法从废水样品中提取SMX具有较好的灵敏度，结果显示检出限为0.5 μg/L，定量限为1.7 μg/L，相对标准差小于6%，加标回收率96%～98%，说明回收率高，重复性好。

李晓晶等[19]建立了超声辅助分散液液微萃取来提取分析水中13种SAs，以乙腈为分散剂，四氯乙烷为萃取剂，利用超声波来辅助DLLME，能减少萃取时间，提高萃取效率。在优化条件下，一定浓度范围内线性关系良好，检出限0.6～2.4 ng/L，加标回收率80.3%～101.8%，相对标准差0.4%～4.5%。MAE和UE属于强化手段，较为简单、快速且环境友好，不少学者用这两种萃取方法来提高萃取效率，相关应用和研究也取得了很多进展。

1.3 固相萃取

固相萃取(Solid Phase Extraction,SPE)是基于液固色谱理论的发展，通过固体吸附剂将目标组分选择性以实现分离和纯化。与液液萃取相比，SPE使用较少的有机溶剂，无乳化现象，萃取的回收率也较高，更易于自动化，这使得固相萃取成为应用最广泛样品前处理技术之一。近几十年来，学者们将传统的固相萃取技术进行改进，逐渐发展为分散固相萃取、固相微萃取、磁性固相萃取等。

1.3.1 常规固相萃取 固相萃取中，吸附剂尤为重要，为了提高萃取的性能，人们探索出新型吸附剂材料，如石墨烯和石墨烯基复合材料、碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNT)、金属有机骨架(Metal Organic Framework,MOFs)和共价有机骨架(Covalent Organic Frameworks,COFs)等。这些材料具有比表面积高、孔隙率大的特性，还有一定的机械强度在痕量分析物的预处理技术方面有广阔的应用前景[20]。Dai等[21]将金属有机骨架材料MIL-101(Cr)作吸附剂应用于水中4种磺胺类化合物的前处理。研究发现，MIL-101(Cr)不饱和金属位点多，化学稳定性更好。结果显示4种SAs在0.2～40 μg/L或0.5～100 μg/L线性关系良好，回归系数在0.996 8～0.998 8之间，检出限0.03～0.08 μg/L，定量限0.11～0.27 μg/L，相对标准差小于3.1%。该实验还用分子对接技术应用于研究MIL-101(Cr)和SAs之间的结合能和吸附特性。Deng等[22]运用同种方法将卟啉金属有机骨架(PCN-224)作为固相萃取的吸附剂来对水环境中6种痕量SAs进行富集并分析。6种磺胺类药物线性范围0.5～2 000 μg/L，相关系数大于0.996，检出限为0.07～0.47 ng/L，相对标准偏差0.4%～3.7%。该方法线性范围宽，重现性好，检出限低，因此对水中磺胺类化合物萃取分析有很大的潜力。

1.3.2 固相微萃取 固相微萃取(Solid Phase Microextraction,SPME)是基于采用涂有固定相的熔融石英纤维(或其他材料)来吸附富集待测物质，然后将富集待测物质的纤维进行解吸并分析。周爱霞等[23]应用固相微萃取对地下水中SAs进行提取，经过HLB萃取膜和C18固相微萃取膜的对比分析，选用了回收率更高的HLB萃取膜。4种SAs在0.005%～10.0 mg/L的范围内线性关系良好，相关系数大于0.999 9，检出限1.08～4.63 ng/L，相对标准偏差0.1%～0.4%，加标回收率69.8%～117.6%。Kazemi等[24]研究了石墨烯氧化硅复合增强中空纤维作为一种新型的模拟搅拌棒固相微萃取装置来萃取水中磺胺嘧啶(Sulfadiazine,SDZ)。在优化条件下，该方法线性范围5～150 μg/L，检出限为1.5 μg/L，SDZ浓度为60 μg/L时，日内和日间相对标准差为2.9%和5.8%，样品回收率94.3%～99.6%。此方法结合了氧化石墨烯的高吸附能力、CTAB法的协同作用以及中空纤维的样品净化能力，装置简单且为一次性，有效避免了交叉污染。该方法高效、成本低、无溶剂且环保，拥有广阔的应用前景。

1.3.3 分散固相萃取 分散固相萃取(dispersive Solid Phase Extraction,d-SPE)是将SPE用的固定相颗粒分散在样品溶液中，使其中的基体物质或共存干扰物吸附在固定相上，分离后去除。其中最典型的应用是QuEChERS法，即快速(Quick)、简单(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)和安全(Safe)。Zhang等[25]采用介孔石墨碳氮化物(MCN)作为吸附剂，设计了一种新型柱辅助分散固相萃取(CA-dSPE)的方法。在优化条件下，萃取的5种SAs检出限为20～5 pg/mL，加标回收率90.1%～110.5%，相对标准偏差0.5%～3.8%。An等[26]以二硫化钼为吸附剂采用分散固相萃取来富集环境水样中4种SAs，二硫化钼具有与石墨烯相似的层状结构，并能形成较大的平面Mo—S键，吸附性能更好。结果显示，在0.5～50 μg/mL线性范围内良好，检出限为0.05～0.12 μg/mL，加标回收率82.02%～119.94%，相对标准差0.65%～9.1%。该方法绿色简便，灵敏且精确，还扩展了MoS2的应用。

1.3.4 磁性固相萃取 近年来，学者们将分散固相萃取与其他方法相结合，发展出许多新的组合萃取技术，磁性固相萃取是基于磁性吸附剂的固相萃取技术，大多都以分散固相萃取的形式应用。 Kazemi等[27]成功将分散微固相萃取(DMSPE)应用于水样中SDZ的测定，采用合成的氧化铁功能化石墨烯氧化物作为高效吸附剂。DMSPE基于吸附剂在含有目标分析物的样品溶液中的分散，短时间内，吸附剂与分析物完全相互作用，使得萃取时间显著减少。此外，为克服吸附剂石墨烯氧化物的水溶性好，与水相分离困难这一特点，该团队将磁的特性引入石墨烯氧化物，两种特性结合后，萃取速度明显加快。结果显示线性范围为1～800 μg/L，检出限 0.34 μg/L，日内和日间相对标准偏差3.1%和5.4%。该方法萃取速度快，效率高且检出率低，是非常有前景的萃取技术之一。Tolmacheva等[28]制备了一种新型的磁性固相萃取(MSPE)吸附剂——磁性超高交联聚苯乙烯(HCP/Fe3O4)来萃取水样中4种磺胺类化合物。检出限0.21～0.33 ng/mL，回收率在84%～105%间，相对标准偏差3%～10%。将预合成的Fe3O4纳米粒子吸附在HCP上，显著提高了吸附能力。Xu等[29]合成了一种磁性表面双模板分子印迹聚合物(MSdt-MIPs)作磁性吸附剂来萃取水中SAs。分子印迹聚合物(MIPs)具有选择性高，机械和化学稳定性好，可重复使用等优点。实验在20～2 000 ng/L的范围内表现出良好线性的关系，检测限为3.0～4.7 ng/L。因此，新合成的MSdt-MIPs不仅具有超顺磁性，而且对SAs选择性很高，表现出较高的稳定性和吸附效率。Yuan等[30]采用了磁性固相萃取结合分散液液微萃取对水中8种SAs测定进行预处理，该研究制备了聚吡咯改性磁性多壁碳纳米管作为磁性固相萃取的吸附剂，改良了对磺胺类化合物的吸附性能。实验结果显示，检出限为1.02～2.97 ng/L，定量限为3.05～9.89 ng/L，加标回收率78.3%～95.6%，相对标准差小于8.5%。该方法适用于实际环境水样的分析，相较单纯的传统固相萃取而言，有更好的纯化能力，提高了对磺胺类化合物的萃取效果，提高了分析的灵敏度。磁性固相萃取近年来受到许多学者的关注，特别是在复杂组分的样品中进行萃取分析时，因此也将成为萃取技术的一个重要发展方向，拥有广阔的应用前景。

2 检测技术

对水环境中的痕量SAs检测方法主要有液相色谱法、紫外可见分光光度法(UV-Vis)、毛细管电泳法(Capillary Electrophoresis,CE)、电化学法以及其他新型检测技术。

2.1 液相色谱法

液相色谱法是检测水中SAs应用较早，也是应用最广泛的方法之一，其优点是灵敏，准确，分析速度快，这些年来逐渐发展为高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、超高效液相色谱(Ultra High Performance Liquid Chromatography,UHPLC)，与质谱联用还能提高选择性和灵敏度，常见的有高效液相色谱-串联质谱联用(HPLC-MS/MS)等。液相色谱常用的检测器有紫外检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器等。其缺点是检测设备复杂体积庞大，设备维护费用高，且需要大量流动相有机试剂易导致试剂浪费和环境污染，故仍不适用于大规模检测应用[31]。

Yuan等[32]采取了固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(SPE-UHPLC-MS/MS)法测定污水处理厂中磺胺类抗生素及其乙酰化产物。检出限为0.01～0.23 ng/L，定量限为0.03～0.78 ng/L，相对标准偏差小于9.6%，回收率77.7%～148.1%。该实验首次对水中乙酰化磺胺类化合物进行检测，由于大多数人和动物在接触抗生素后都会发生乙酰化，此类代谢物可能重新转变为其母体化合物，乙酰化磺胺类抗生素比母体溶解度低，易析出结晶，产生结晶尿，增加肾毒性[33]。由于国内目前对其研究较少，因此对其进行检测和研究有着重要意义。王大鹏等[34]也使用类似方法(SPE-HPLC-MS/MS)对污水中磺胺类抗生素及其乙酰化产物进行检测。由于基质效应，复杂基质样品会严重抑制或增强目标化合物的离子化，降低HPLC-MS/MS精确度和准确度[35]，因此该方法使用13C标记的同位素内标来为消除这一效应的影响，并成功应用于污水处理厂的目标物检测分析。Yang等[36]建立了中空纤维液相微萃取结合超高效液相色谱-荧光法(UHPLC-FLD)测定水中SAs的方法。在优化条件下，测定的8种SAs在0.05～5 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数为0.992 4～0.999 4，检出限为3.1～11.2 ng/L，定量限为10.3～37.3 ng/L。该方法可以同时萃取和检测多种磺胺类化合物。

2.2 紫外可见分光光度法

紫外可见分光光度法操作方便，仪器简单，使用成本低且重现性好，但紫外检测灵敏度相对不高，部分应用受到限制。Errayess等[37]建立了固相萃取-紫外可见分光光度法来测定海水中的磺胺类抗生素，检测的8种SAs的检测限和定量限分别为0.019～0.05 μg/mL和0.06～0.16 μg/mL。相对标准偏差介于1.2%～6.4%之间。该团队还对UPLC-MS与紫外可见分光光度法进行对比，结果表明分光光度法更接近于标准偏差较低的海水样品的加标浓度，说明了分光光度法准确性。

2.3 毛细管电泳法

CE技术优势在于分离效率高，分析速度快，实际消耗低，样品前处理简单。Mala等[38]提出了一种新的电喷雾电离结合质谱法(Electrospray Ionization-Mass Spectrometric,ESI-MS)：CE聚焦于逆电迁移色散梯度，并将其首次应用于水中SAs的检测。测得水样中几种SAs的检出限为0.8 ng/mL。该方法不需要任何样品的预处理，在痕量分析物的快速，高灵敏度分析上有着巨大潜力。Ji等[39]提出一种新型毛细管电泳检测器——镀银检测窗口和毛细管柱内光纤发光二极管诱导荧光检测器(SDW-ICOF-LED-IFD)。结果显示，将有无镀银检测窗口的两种毛细管电泳检测系统进行对比，检出限分别为1.0～2.0 nmol/L和2.5～7.7 nmol/L，日内和日间迁移时间和相应峰值面积的精度均小于0.86%和3.86%，回收率在92.5%～102.9%之间。说明改进后的CE系统灵敏度高，重现性好，准确度更高。

2.4 电化学法

Lahcen等[40]研究了基于多种碳纳米材料碳糊电极伏安法测定SAs。采用方波伏安法对磺胺甲恶唑(Sulfamethoxazole,SMX)进行分析，研究发现纳米碳碳糊电极对SMX具有较高灵敏度和较低的检出限(0.12 μmol/L)，且有良好的回收率(95.5%～100.2%)。Roman等[41]研制了一种基于酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)的一次性生物传感器电化学法用于测定SMX。该传感器将TYR和金纳米颗粒固定在丝网印刷碳电极(Screen-printed Carbon Electrodes,SPCEs)上，采用SPCEs对SMX进行电流检测和定量，提高了电化学检测的选择性和灵敏度。结果显示SMX在10～190 μmol/L内线性关系良好，相关系数为0.996，日内和日间相对标准偏差5.8%和6.7%。该方法在回收率、RSD、95%置信区间方面均取得满意成果，可应用于不同水样的SMX测定。

3 结语

磺胺类抗生素以痕量形式残留于水体环境中，其对人类健康及生态环境都存在着潜在威胁。目前国内外对水中SAs的检测技术前处理方面研究热点主要集中于基于固相萃取技术发展萃取技术：SPME、d-SPE、MSPE以及各种组合工艺。未来研究的趋势也仍是组合技术的联用以及对萃取性能更好的吸附剂材料的研究。检测分析方面当前应用主要以HPLC-MS或HPLC-MS/MS及其组合工艺为主，此类方法优点是灵敏度高，检出限低，重复性好，然而由于检测设备复杂昂贵，成本较高，仍不适用于大规模检测应用。因此，结合我国复杂的水体环境状况及国内外饮用水安全技术研究进展，开发出灵敏、准确、廉价的检测方法显得尤为重要。此外，由SAs导致的抗性基因和抗性菌对人类健康和生态安全造成的威胁也不容忽视，对它们检测分析仍然需要进一步研究。