啮齿类动物子宫内膜异位症模型的研究进展*

时 光 赵瑞华

(中国中医科学院广安门医院妇科，北京 100053)

子宫内膜异位症(EM，简称内异症)是指子宫内膜组织出现在子宫腔以外的部位，以疼痛、不孕、盆腔包块为主要临床表现的疾病[1-2]。5%～10%的育龄期妇女患有内异症，且50%的内异症患者合并不孕[2-3]。目前内异症的发病机理尚不明确，应用有效的动物模型对内异症的发病机制开展研究，并进行靶向治疗尤为重要[4]。目前公认的内异症发病机制是Sampson的经血逆流理论[5]，在此理论基础上建立了多种内异症模型。

内异症动物模型建立方法包括两种：一种为自发的动物模型，多是以非人灵长类动物作为研究对象建立动物模型，因其具有自发性的月经，与人的内异症形成的经血逆流学说较为相似，更加符合内异症的发病特点，但由于模型建立耗时长，实验代价较大，且有伦理限制，现很少应用；另一种为诱发的动物模型，主要的动物选择为啮齿类动物。本篇文章主要对诱发性子宫内膜异位症模型进行综述。

1 造模前准备

在诱导动物模型之前，需要进行阴道分泌物的涂片以确定动情周期，选择动情周期规律(至少检测两个连续4 d的动情周期)动物进行模型的诱导[6-8]。不同研究选用动情周期的不同期分别建立模型。研究中有选择动情前期[6]，动情间期[7]或动情后期[8]进行子宫切除，认为动情后期或间期的内膜与人经期的内膜相似，从而模拟经血逆流的理论。另外，在模型建立之前，有些研究将动物进行卵巢去势手术并给予雌激素或孕马血清促性腺激素(PMSG)[9-14]，使大鼠处于统一的标准，且在造模前给予雌激素刺激子宫内膜组织的生长[15]，使其处于相同的卵巢周期，如动情期，从而排除个体动物因为不同的性激素水平而导致的子宫内膜病灶发展过程中的差异[16]。

2 动物模型的建立

2.1 同源模型的建立

同源模型中子宫内膜来源于啮齿类动物的子宫，采用缝合或扩散的方式种植于腹腔。主要包括同种自体移植及同种异体移植。

同源诱导的内异症模型最早为Vernon和Wilson[17]提出，主要为自体移植。腹部切口暴露子宫，切除一侧子宫，纵向剖开，分为5 mm×5 mm的片状，应用(6-0)的非可吸收线将内膜面垂直固定于腹壁。并于移植后的2周，剖腹检查子宫内膜的黏附情况及活性。在Celik等[18]的研究中，从子宫角切除0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的片状内膜黏附于右侧腹壁接近动脉的位置。在Rothmund等[19]的研究中，造模前给予所有的大鼠雌激素(50 μg/kg)每周两次，开腹后，在子宫输卵管处及子宫宫颈处结扎一侧子宫角，纵形切口暴露内膜并且将子宫角分为4片，每片6 mm×3 mm。每侧腹壁分别缝2片子宫角，内膜面朝向腹腔，关腹。内异症诱导后14 d进行二次手术。

同种异体移植的方法主要是切除同源供体鼠的子宫，移植于受体鼠腹腔。研究中切除大鼠子宫，并将内膜层与肌层分开，子宫内膜碎片缝合在腹壁近血管处。术后3 d连续皮下注射雌激素[20]。在Taniguchi等[21]的研究中，供体鼠及受体鼠均行卵巢去势手术并且皮下注射雌激素，在卵巢去势2周后，切除供体鼠的子宫，纵向切开并切碎，切碎后加入500 μL盐水，以1∶2供体子宫与受体子宫比例移植，并注入腹腔，每只鼠约注射50 mg的子宫组织。在Li等[11]的研究中，注射PMSG 48 h后，取供体鼠的子宫，分离子宫肌层后，将子宫内膜细胞悬液注入卵巢去势的受体CD-1小鼠，轻柔的按摩使组织碎片扩散。术后2周及造模前4 d，受体小鼠皮下注射雌二醇，之后每4 d注射一次，维持内异症的发展。

2.2 异源模型的建立

异源内异症动物模型中，应用人子宫内膜组织腹腔或皮下注射到免疫缺陷的小鼠体内[22]。在Perelló等[23]的研究中，取妇科良性疾病手术妇女的子宫内膜种植于裸鼠体内。在Yesildaglar的研究中，内异症患者的内膜细胞经皮下种植于严重的结合性免疫缺陷(SCID)的小鼠体内[24]。在Delgado-Rosas等[25]的研究中，将60 d缓释的无菌雌激素胶囊植入36只卵巢去势的裸鼠颈部。4 d后，取自然月经周期捐赠卵母细胞的无内异症者新鲜的子宫内膜。将子宫内膜切成3 mm×3 mm的碎片，应用黏合剂将内膜碎片贴于每只小鼠的腹壁。在Herington等[12]的研究中，在无胸腺的裸鼠进行卵巢去势手术后5～10 d，将人的内膜组织腹腔注射建立动物模型。提供者取增殖期的内膜样本[26]。提供内膜的女性需要有规律的月经周期，无药物治疗史或手术分离黏连或内膜疾病或内异症病史，血清孕激素<1.5 ng/mL，并排除近3个月内有激素治疗的或其他的可能影响研究结果者[12]。

3 新型的子宫内膜异位症模型建立

3.1 荧光标记子宫内膜异位症模型

一些模型应用绿色荧光蛋白GFPcDNA作为供体或受体在位内膜组织的标记物[7, 13, 15, 27-30]。应用绿色荧光蛋白小鼠移植的内膜碎片移植到腹腔，可以帮助分析形态学改变及血管生成的过程。病灶多为囊性和血管生成，形态学标志如子宫内膜腺体和间质[28]。在异源的模型也应用荧光作为标记物，卵巢去势及激素替代的裸鼠注射荧光标记的人子宫内膜碎片[31]。

3.2 腹腔镜辅助子宫内膜异位症模型建立

近年来有学者通过使用腹腔镜的方法建立子宫内膜异位症模型。在Peterse等的研究中，从小鼠腹部尾端到剑突的3.5 mm切口，置入内镜，在腹腔镜引导下从动物的左右两侧置入两个14 G的静脉内导管，将1 mm3内膜片植入腹腔。左，右侧腹壁各植入4片内膜，子宫底与远端结肠之间植入2片内膜。操作持续时间为20 min[8]。Peterse的另一个实验，通过录像将腹腔镜诱导子宫内膜异位症的步骤展现出来。卵巢去势的C57BL/6JRj小鼠模仿人的雌孕激素序贯(皮下注射100 ng 17β雌二醇3 d，休息3 d后，背部植入孕酮联合皮下注射5 ng 17β雌二醇)人工周期的方法，后应用芝麻油的刺激诱导内膜的蜕膜化。孕激素撤退4 d后月经来潮[32]，取经期的子宫内膜，应用腹腔镜的方法[8]将经期内膜种植于同源的受体小鼠的腹腔诱导内异症产生[33]，该方法较准确地模拟了Sampson的经血逆流理论[5]。

3.3 嵌合人类/小鼠子宫内膜异位症模型

在Brunertran的研究中，为了证明人免疫细胞在内异症中的作用建立了嵌合人类/小鼠的实验模型。取无内异症月经规律的捐献者的增生期子宫内膜组织，同时要求捐献者满足子宫内膜厚≥9 mm(经阴道彩超确定)，血清孕激素≤1.5 ng/mL。将获得的内膜组织放入培养液中培养[34]，并从捐赠者50 mL的血样本中分离人外周血单核细胞及中性粒细胞。在Rag2γ(c)小鼠进行卵巢去势手术后迅速在皮下种植缓释的雌激素胶囊。子宫内膜组织培养24 h后，注射小鼠体内。部分小鼠在人的内膜组织注射到腹腔前，注射单独做过标记的人类淋巴细胞。通过实验证明在小鼠体内，免疫细胞具有限制腹膜内疾病的能力，表明啮齿类动物的免疫系统是具有防止内异症发展的能力[14]。

3.4 其他部位的子宫内膜异位症模型

内异症的诱导模型中，除了将内膜组织缝合或注射进入腹腔外，还可以将内膜组织种植于其他部位诱导内异症的模型。如将子宫内膜组织移植在腓肠肌建立肌肉内异症模型。同时也可以将子宫组织缝于小肠系膜手术诱导子宫内膜异位症[35-38]。

4 啮齿类动物诱导内异症模型的结果分析

在对动物进行模型诱导后，需要二次手术以确定模型建立是否成功。因研究不同两次手术之间的间隔时间以1周、2周、3周、4周、6周、8周各异[8，16，18，22，39-40]。在Bruner-tran等[41]的研究中，不同时间人的内膜碎片观察结果如下：人的内膜碎片在第4小时会与小鼠腹壁松散黏连，轻轻地用镊子可以将组织分开。到第16小时内膜组织与小鼠的间皮紧密黏连，在组织不损伤的情况下不能将其分离。显微镜检查表明小鼠间皮细胞与人体组织的明显包裹，可能影响异位人内膜与小鼠腹壁表面稳定性。到第24小时，来源于人类组织的鼠源性新生血管生成明显，到第5天病灶的血供建立。第10天大体观察表明血管生成继续发展，显微镜分析表明异位内膜组织重塑。

内异症病灶进一步通过病灶的大小表现，较大的标记为“a”，较小的标记为“b”及总体的量，通过标准的公式进行计算：V=a×b2×0.5[42]。在人体组织腹腔内诱导5 d后，判断腹腔黏连的有无及异位病灶的内膜增长的出现及发展。通过Lauder等[43]所描述的方法对黏连的数量、强度及分布进行评分。0分：无黏连；1分：薄型黏连；2分：多于1个的薄型黏连；3分：厚的黏连带；4分：厚的表面附着黏连；5分：非常厚的血管生成的黏连或者多于1个表面附着黏连[41]。Quereda等对种植物的生长及内异症的阶段进行分级，分为4级。0级:无种植物体，或种植物较小未形成囊肿；Ⅰ级:种植物形成直径<2 mm囊泡，或大于2 mm的坚实的组织；Ⅱ级:种植物形成直径≥2 mm但<4.5 mm(小于种植最初的大小)的液性囊泡；Ⅲ级:囊泡的直径与种植物最初大小相似，或比原始的种植物更大(≥4.5 mm)。实验性子宫内异症阶段：微小，三种移植物的总的生长等级≤2；轻度，总的生长等级为3或4；中度，总的生长等级为5或6；重度，总的生长等级≥7。

5 啮齿类动物诱导内异症模型的评价

啮齿类动物子宫内膜异位症模型的优点是啮齿类动物的成本相对较低并且比非人灵长类动物更容易获得。同源模型中，选择具有相似基因特点的近交系动物，避免异位组织的排斥反应[16]，有利于进行长期的研究，且具有可重复性。同源内异症手术诱导模型具有完整的免疫系统，适合进行内异症机制的研究，包括在位内膜及异位内膜，并且可用在研究药物的功能和内异症的免疫及炎症反应。异源内异症小鼠模型，一些裸鼠是以人类子宫内膜为基础，没有完整的免疫系统的，它们可以被用来评价疾病的病因及用于药物和激素调节的治疗性检测[44]。

应用啮齿类动物诱导子宫内膜异位症模型最大的缺点是人与啮齿类动物属于不同物种，具有不同的生理特点，通过啮齿类动物得到的结果是否适用于人仍然是具有争议的。此外，部分手术步骤是值得怀疑的。啮齿类动物没有月经，内异症必须通过自体移植子宫组织进行诱导，在大部分啮齿类动物研究中，子宫碎片包括肌层，这样可能会影响病灶的发展，并且当评价异位病灶的重量及大小的时候，肌层占一定比例。另外手术后产生的炎症及可能存在其他的潜在的影响，未来研究中需要对腹腔手术步骤进行规范以确保造模方式的可信性[12]。

鉴于传统剖腹手术中的问题，创新的应用腹腔镜辅助造模的方法正在发展，与传统的剖腹手术或盲目的腹腔内注入子宫内膜组织相比，创新的方法创伤更小，成功率更高[8]。同时通过腹腔镜引导可进行可视化操作。子宫内膜碎片组织可以种植在内异症病人典型的发病位置，增加了模型的比较医学价值[45]。

6 结论

动物模型对于研究人类子宫内异症的病理生理机制、疾病的发展和疾病的治疗方法尤为重要。本综述介绍了不同的建立子宫内膜异位症模型的方法，并且介绍了不同方法的步骤及模型的结果，评价。当选择一种动物模型的时候，应该考虑具体的影响因素，包括时间、花费、研究目的与使用的方法，视情况而定。