CAV-1感染MDCK中各IFN及受体分子表达谱的差异*

孟 兴 佟相慧 陈洪岩 韩凌霞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物与比较医学团队/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150069)

干扰素(IFN)是机体免疫调节和抗病毒感染的一类重要细胞因子，通过受体介导活化效应细胞发挥功能。IFN是依据受体分子划分的。干扰素I型干扰素的受体广泛分布于单核细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、血小板、内皮细胞、肿瘤细胞等，II型干扰素的受体与I型干扰素受体有一定的同源性，分布也较广泛。III型干扰素的受体主要分布于各种内皮细胞[1-2]。

Ⅲ型干扰素包含多个IFN-λ家族。目前已鉴定出人有IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3和IFN-λ4等4种[3]，猪有IFN-λ1和IFN-λ3[4]。猪IFN-λ1和IFN-λ3可以抑制猪流行性腹泻病毒在猪肠内皮细胞复制[5]，小鼠IFN-λ可以调控小鼠诺如病毒在肠黏膜表面的感染[6]。目前文献报道中只有犬IFN-λ1，公布了IFN-λ3的推测序列[7]，而IFN-λ3在犬体外的基础表达量如何，尚未见报道。

犬肾小管上皮细胞(Madin-Darby canine kidney,MDCK)是最常用的犬细胞系，来源于考克斯班尼犬肾脏，该肾脏细胞原代培养时其形态类似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶/EDTA消化液的连续6次消化培养而纯化成上皮样细胞，具有远端肾小管与集合管细胞的分化特性，被广泛用于代谢研究和药物筛选研究，尤其是犬病病毒和流感病毒体外培养的支持系统。仅2019年在中国知网上以“MDCK细胞”为关键词搜索到的正式发表论文就有18篇，研究内容涉及抗生素对MDCK细胞的凋亡[8]、犬病毒感染[9]以及禽流感病毒的研究[10-11]。

聚肌胞苷酸(PolyI∶C)是双链RNA的类似物，常用于干扰素的诱导剂。犬I型腺病毒(CAV-1)引起的犬传染性肝炎是全球养犬业和毛皮经济动物养殖业危害最严重的疾病之一，主要通过疫苗免疫[12]。本研究利用定量PCR技术分别检测了正常MDCK、Poly I∶C刺激和CAV-1感染后，以初步了解MDCK内各种IFN及其受体分子的转录表达水平。

1 材料与方法

1.1 材料

犬肾细胞系(MDCK)由本实验室保存。犬腺病毒1型(CAV-1)由军事医学科学院军事兽医研究所扈荣良教授惠赠。PolyI∶C购自Sigma公司；TransStart Tip Green qPCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1不同亚型犬IFN及其受体分子的相对定量PCR方法的建立：用含5%新生牛血清的DMEM培养液培养MDCK细胞，于37 ℃ 5% CO2培养箱内培养成单层。按照产品说明书，用Simply P总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，用TaKaRa反转录(SYBR用)反转录试剂盒反转录为cDNA。根据NCBI上公布的犬IFN各亚型及其受体分子的核苷酸序列(见表1)，利用Primer 5.0软件，设计染料法相对定量PCR(qPCR)方法特异性引物，由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。IFN-α[13]和IFN-λ1[14]的特异性引物来自参考文献。qPCR反应体系为：2×Trans Start Tip Green qPCR Super Mix 10 μL、引物(10 μmol/L)各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。反应程序为：94 ℃ 30 s、94 ℃ 5 s、72 ℃ 30 s，40个循环。均以GADPH为内参。PCR产物经试剂盒回收，以扩增引物为测序引物，双向测序。测得的有效序列与NCBI发布的参考序列进行同源性比对。

表1 犬IFN及其受体分子的相对定量PCR方法的引物信息Table 1 Primer information for quantitative PCR assays for canine IFNs and their receptor molecules

1.2.2MDCK细胞中各干扰素及其受体转录水平的检测：正常培养MDCK细胞，长成单层后，弃掉培养液，反复冻融细胞瓶，收获细胞。同1.2.1方法提取总RNA，随机引物反转录成cDNA。以GAPDH为内参基因，以目的基因的Ct值减去内参基因的Ct值作为该被检基因的ΔCt值，通过ΔCt值比较正常MDCK细胞中各IFN及其受体分子的相对含量。

1.2.3Poly I∶C处理的MDCK细胞中各干扰素及其受体转录水平的检测：利用100 ng/mL Poly I∶C处理MDCK单层细胞，用2%血清浓度的DMEM培养液于37℃ 5% CO2培养箱内培养，24 h后收获细胞。提取以正常MDCK细胞中的作对照，利用定量PCR，检测MDCK中IFN-β、IFNAR1、IFN-λ1、IFN-λ1R、IFN-λ3和IFN-λ3R转录水平的相对含量。

1.2.4CAV-1感染MDCK细胞中各干扰素及其受体相对转录水平的检测：将MDCK细胞铺到6孔板中，待密度达到70%～80%，弃去培养板中的培养基，PBS洗两遍。加入MOI=1的CAV-1病毒，37 ℃感作1.5 h后，更换血清终浓度为2%的DMEM维持液，37 ℃细胞培养箱培养。24 h后采用冻融方式收获细胞。设正常MDCK细胞作对照。提取病毒总RNA，反转录为cDNA，进行定量PCR，分析IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R的相对转录水平。

1.3 统计方法

对所测样品的数值进行计算，用2-ΔΔCt表示，其中ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值，ΔΔCt=处理组ΔCt-对照组ΔCt。比较处理组与对照组的目的基因的水平差异。采用SPSS 16.0软件对所得数据进行分析。各组数据均以平均值±标准差表示，用t检验分析数据，P<0.05为统计学显著性差异，P<0.01为极显著。

2 结果

2.1 犬各干扰素及其受体分子定量PCR方法的建立

以MDCK细胞cDNA为模板，按照优化条件，对各IFN分子及其受体分子进行定量PCR反应。熔解曲线可见均为单峰，无杂峰，表明特异性较好(图1)，各被检基因可以同时上机反应。Blast序列比对结果表明，IFN-λ3的扩增产物序列与NCBI发布的IFN-λ3推测序列XM-02542186.1的同源性为100%。

图1 犬IFN分子及其受体分子的定量PCR检测峰图Fig.1 Results of quantitative PCR of various canine IFNs and their receptor molecules

2.2 MDCK细胞中各干扰素及其受体的水平的检测

针对内参基因GAPDH的相对定量计算结果表明，培养24 h的MDCK细胞中，IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ3、IFNAR1、IFN-λ1R和IFN-λ3R基因的转录产物都能明显检测到，且IFN-λ3R的ΔCt极显著低于其他被检分子(P<0.001)，即其转录含量均极显著高于其他被检分子，见图2。

图2 MDCK细胞中IFN及其受体分子的相对转录水平(用循环数表示)注：***P<0.001Fig.2 Relative transcriptional levels of various IFNs in MDCK (displayed as cycle numbers)Note：***P<0.001

2.3 Poly I∶C处理的MDCK细胞中各干扰素及其受体转录水平的检测

用Poly I∶C处理MDCK细胞24 h后，定量PCR检测结果表明，IFN-λ1R的转录水平最高，极显著高于IFN-λ1和IFNAR1(P<0.01)，高于IFN-β、IFNAR1、IFN-λ3和IFN-λ3R，但未达到统计学差异，见图3。

图3 Poly I∶C处理MDCK细胞中各IFN及其受体分子转录水平的相对含量注：**P<0.01Fig.3 Comparative expression of mRNA transcription levelsamongIFNs in Poly I∶C-treated MDCK CellsNote：**P<0.01

2.4 CAV-1感染MDCK细胞中各干扰素及其受体相对转录水平的检测

MDCK细胞感染CAV-1 24 h后，与正常细胞比较，IFN-α的含量显著上升，是正常细胞的6倍以上，显著高于IFN-λ1(P<0.05)，极显著高于IFN-λ1R、IFNAR1、IFN-λ3、IFN-λ3R和IFN-β的转录水平(P<0.01)，见图4。

图4 CAV-1感染MDCK细胞后各干扰素及其受体mRNA含量的相对比较注：*P<0.05，**P<0.01Fig.4 Comparison of IFN and its receptor mRNA contents in MDCK cells infected with CAV-1Note：*P<0.05, **P<0.01

3 讨论

IFN-λ的受体蛋白IFNLR是IL-28Rα链和IL-10Rβ链组成的异二聚体，IFN-α/β的受体是IFNAR1和IFNAR2组成的异二聚体IFNAR[15-16]。IFNⅠ型与III型干扰素都有抗病毒的功能，但是IFN-λ比IFN-α/β对内皮细胞的作用更强，对黏膜感染更有特异性[17]。例如，IFN-λ通过结合肠内皮细胞表面的受体，能间接调控小鼠诺如病毒引起的持续感染、粪排毒以及组织中的病毒含量[6]，而INF II型以免疫调节为主。

之前已有报道在正常MDCK内检测到了IFN-λ1R和IFN-λ3转录产物，但未比较转录水平[14]。本研究结果表明，正常MDCK细胞内，IFN-β、IFN-λ1和IFN-λ3的转录水平相近。III型IFN中的λ1受体基因(IFN-λ1R)与I型IFN的受体基因(IFNAR1)转录水平相近，但均远低于λ3的受体分子(λ3R)，达到极显著性差异。

经过Poly I∶C刺激24 h后，MDCK内转录出的IFN-β和IFN-λ1接近，虽低于IFN-λ3，但没有统计学意义。3种被检受体分子中，IFN-λ1R的含量比正常细胞多了3倍有余，与I型IFN的受体分子基因达到极显著性，与同是III型的λ3受体无统计学差异。Ichihashi等用Poly I∶C处理MDCK 24 h后，IFN-λ3的转录水平升高达到了显著性[14]。

体内研究结果表明，腺病毒能够介导IFN-γ基因的表达[18]。已有报道表明病毒感染后，Ⅰ型IFN与III型干扰素虽然都有抗病毒功能，二者的受体分子的氨基酸同源性只有30%，但胞内信号转导机制类似[19]。MDCK感染I型腺病毒24 h后，除IFN-α的表达量明显上调外，其他干扰素及其受体分子之间均无显著性差异，表现出与Poly I∶C的刺激结果明显不同的表达谱。提示在利用Poly I∶C作为刺激剂对照时，应考虑到其代表性。

本研究探讨了犬MDCK细胞中I型和III型干扰素受体分子的表达谱，并与Poly I∶C处理和腺病毒感染进行了比较，为利用MDCK开展研究提供了一定思路。