复方钩藤口服液的制备及其对小鼠睡眠的改善

(遵义医科大学药学院药物分析教研室,贵州遵义 563003)

随着社会节奏的加快及竞争的日益激烈,睡眠问题逐渐成为各种慢性疾病的源头之一。目前临床上采用药物治疗睡眠问题中的失眠症有化学合成药物和中药治疗两大类方法,其中化学合成药治疗具有药效发挥快、疗效明确等优点,但也存在成瘾性以及耐药性强等不良反应而在使用上受到限制[1]。中药治疗失眠症历史悠久,历代医家对失眠诊治的一般规律是补虚泻实,多以心经、肝经入手来调理脏腑阴阳平衡，取得较好效果,而且许多具有天然镇静催眠功效的中草药均安全、无毒、副作用小[2]。

复方钩藤口服液组方主要包括:钩藤、天麻、酸枣仁、远志、山萸肉。其中钩藤味甘性凉,入肝、心经可清热平肝,钩藤碱是钩藤的主要有效成分之一,有显著的中枢抑制作用,能对抗咖啡因所致的中枢兴奋作用,延长小鼠的睡眠时间[3-6]。天麻甘平柔润,入肝经养液平肝,具有较好的镇静助眠功效,其主要活性成分天麻素可明显延长阈剂量戊巴比妥钠致小鼠睡眠持续时间[7-10]。辅以的酸枣仁是镇静安神佳品,甘酸质润,可养血补肝[11];远志味苦性温,常用于心肾不交引起的失眠多梦,健忘惊悸等[12];山萸肉入肝肾经,可补阴血不足;几味药合用可起到宁心除烦、镇静安神的功效。

因此,为开发以中草药为原料的天然、无毒副作用的可改善睡眠功能的药物,本研究在以经典的钩藤、天麻配伍基础上,为突出药物的镇静催眠功效,增加了酸枣仁、远志等,进行合理组方,采用水提醇沉法制备了复方钩藤口服液,并进一步考察其对改善小鼠睡眠功能的影响,以期为复方钩藤口服液的开发应用提供理论研究基础和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF雄性昆明种小鼠 160只,体重为(20±2) g 购自湖南天勤生物技术有限公司,许可证号:SCXK(湘)2014-0011),实验动物证书号:43006700016411;钩藤 购自贵州省剑河县;天麻、酸枣仁、远志、山萸肉、甘草 购自遵义中药饮片公司(经遵义医科大学附属医院药剂科杨建文主任医师鉴定为真品);钩藤碱对照品(批号:150907)、天麻素对照品(批号:150518) 购自中国食品药品检定研究所;乙醇、氨水、冰醋酸 购自成都科龙化工试剂厂,均为分析纯;甲醇、乙腈 购自迪马科技有限公司,均为色谱纯;戊巴比妥钠,巴比妥钠 购自上海化学试剂公司;实验用水 二次蒸馏水。

RE-2000E型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;安捷伦1260型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司;BT125D型分析天平 北京赛多利斯科学仪器有限公司;pH计 美国EUTEOH公司;SG3300HE型超声清洗仪 上海冠特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复方钩藤口服液的制备工艺 取处方中药材(钩藤、天麻、酸枣仁、远志、山萸肉的比例为2∶3∶3∶1∶1)加水浸泡30 min,以一定的料液比,煎煮一定次数(钩藤在第1次煎煮后20 min加入),煎煮一定的时间,合并滤液,减压浓缩至原体积的1/3,加入一定的浓度乙醇醇沉24 h,过滤,减压浓缩至无醇味,加水调节浓度至含生药0.5 g/mL,放置15 h后,用10% NaOH调节口服液的pH,加入抑菌剂(0.15%的尼泊金甲酯和尼泊金乙酯的等量混合物),搅拌均匀,分装于10 mL棕色玻璃瓶中,100 ℃高温灭菌30 min即得复方钩藤口服液。

1.2.2 正交试验优选复方钩藤口服液的制备工艺 采用L9(34)正交试验设计优选复方钩藤口服液的最佳提取工艺条件,在前期单因素实验的基础上选择加水量(A)、煎煮时间(B)、煎煮次数(C)、醇沉浓度(D)为考察因素,每个因素3个水平,以方中君药钩藤和天麻药材中的有效成分钩藤碱和天麻素为考察指标,采用综合评分法,设定钩藤碱和天麻素所占权重系数各为50%,因素水平见表1。

表1 因素水平表Table 1 TheTable of factors and levels

1.2.3 复方钩藤口服液制剂 pH的确定:用10%氢氧化钠溶液调节口服液pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,灌装,灭菌,分别在4、40 ℃、室温(25 ℃)条件下储藏15 d后,观察pH对口服液澄清度和色泽的影响。

1.2.4 复方钩藤口服液中钩藤碱的含量测定

1.2.4.1 钩藤碱的色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈(A):0.05%冰醋酸缓冲液(加三乙胺调节pH为7.5)(B),梯度洗脱(0 min,40% A;8 min,50% A;20 min,60% A;24 min,80% A);流速为1.0 mL/min;检测波长243 nm;柱温25 ℃;进样量20 μL[13-14]。

1.2.4.2 缺钩藤阴性样品溶液的制备 取组方中除钩藤外其余药材,按复方钩藤口服液的制备方法制备缺钩藤的阴性样品溶液。

1.2.4.3 样品溶液的制备 精密量取复方钩藤口服液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

1.2.4.4 标准曲线的绘制 精密称取钩藤碱对照品10.0 mg,用甲醇溶解定容至10 mL,得1.0 mg的钩藤碱对照品溶液。取钩藤碱对照品溶液,用甲醇分别配制成浓度为1.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg/mL的对照品系列溶液,分别进样20 μL,以峰面积A对浓度C进行线性回归。

1.2.5 复方钩藤口服液中天麻素的含量测定

1.2.5.1 天麻素的色谱条件 色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为水∶乙腈(97∶3);流速1.0 mL/min;检测波长220 nm;柱温25 ℃;进样量20 μL[15]。

1.2.5.2 缺天麻阴性样品溶液的制备 取组方中除天麻外其余药材,按复方钩藤口服液的制备方法制备缺天麻的阴性样品溶液。

1.2.5.3 样品溶液的制备 精密量取1.0 mL复方钩藤口服液,用蒸馏水稀释10倍后,经0.22 μm微孔滤膜过滤,即得。

1.2.5.4 标准曲线的绘制 精密称取天麻素的对照品10.0 mg,用蒸馏水溶解定容至10 mL,得1.0 mg的天麻素对照品溶液。取天麻素对照品溶液,用蒸馏水分别配制浓度为10.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/mL的对照品系列溶液,分别进样20 μL,以峰面积A对浓度 C进行线性回归。

1.2.6 改善睡眠动物试验 将160只健康成年雄性小鼠,随机分成4批,每批分成对照组和复方钩藤口服液高、中、低剂量组,每组10只。实验组按照人体推荐剂量为0.1758 g/kg·d,以此剂量的2.5倍、5倍和10倍,经实验动物剂量换算后,高剂量组灌胃剂量为16 g/kg·BW、中剂量组灌胃剂量为8 g/kg·BW、低剂量组灌胃剂量为4 g/kg·BW,对照组灌胃等体积蒸馏水。4批小鼠每日灌胃一次,连续给药30 d后,观察小鼠喂养前后体重的变化情况,并分别进行直接睡眠试验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验。

1.2.6.1 小鼠体重观察 各组小鼠在室温(25±1) ℃左右连续喂养30 d,观察小鼠喂养前后体重的变化情况。

1.2.6.2 直接睡眠试验 实验小鼠末次灌胃30 min后,观察各组小鼠是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标,即当小鼠置于背卧位时,能立即翻正身位,如超过60 s不能翻正者,即认为翻正反射消失,进入睡眠。翻正反射恢复即为动物觉醒,翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间,记录60 min内对照组与给药组入睡小鼠数及睡眠时间。观察复方钩藤口服液是否有直接诱导睡眠作用[16-18]。

1.2.6.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 实验小鼠末次给药30 min后,按50 mg/kg·BW剂量(预试验确定,可使实验动物100%入睡,但又不使睡眠时间过长的剂量)对各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠,注射量为0.2 mL/20 g·BW,以翻正反射消失为指标,在戊巴比妥钠催眠的基础上,观察复方钩藤口服液是否能延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间[16-18]。

1.2.6.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 小鼠末次给药30 min后,戊巴比妥钠最大阈下催眠剂量35 mg/kg·BW(预试验确定,即80%～90%小鼠翻正反射不消失的剂量)对各组小鼠腹腔注射,注射量为0.2 mL/20 g·BW,记录30 min内入睡小鼠数(翻正反射消失达60 s以上者)[16-18]。

1.2.6.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 实验小鼠末次给药30 min后,各组小鼠腹腔注射350 mg/kg·BW(预试验确定,可使实验动物100%入睡,但又不使睡眠时间过长的剂量)巴比妥钠,注射量为0.2 mL/20 g·BW,以小鼠翻正反射消失达60 s为指标,从注射巴比妥钠到小鼠翻正反射消失即为睡眠潜伏期,观察复方钩藤口服液能否缩短巴比妥钠睡眠潜伏期[16-18]。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 复方钩藤口服液中钩藤碱含量测定的方法学考察

在“1.2.4.1”项色谱条件下,口服液中其它成分不干扰钩藤碱的测定,色谱图见图1。线性方程为A=46.36×C+13.44(r=0.9992),结果表明钩藤碱在1.0～20.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。取浓度为12.0 μg/mL的钩藤碱对照品溶液连续进样,得仪器精密度的RSD为0.2%(n=6);取“1.2.4.3”项下样品溶液连续进样,得方法重复性的RSD为2.7%(n=6);取“1.2.4.3”项下样品溶液按其中钩藤碱含量的120%、100%、80%分别添加钩藤碱对照品溶液,其方法的平均加样回收率为100.72%(RSD=1.09%,n=9)。

图1 复方钩藤口服液中钩藤碱的色谱图Fig.1 Chromatograms of rhynchophylline in CUHOL 注:A：钩藤碱对照品;B：复方钩藤口服液; C：缺钩藤阴性样品;a：钩藤碱。

2.2 口服液中天麻素含量测定的方法学考察

在“1.2.5.1”项色谱条件下,口服液中其它组分不干扰天麻素的测定,色谱图见图2。线性方程为A=35.173×C-8.3907(r=0.9998),结果表明天麻素在10.0～250.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。取浓度为150 μg/mL的天麻素对照品溶液连续进样,得仪器精密度的RSD为0.3%(n=6);取“1.2.5.3”项下样品溶液连续进样,得方法重复性的RSD为0.6%(n=6);取“1.2.5.3”项下样品溶液按其中天麻素含量的120%、100%、80%分别添加天麻素对照品溶液,其方法的平均加样回收率99.46%(RSD=1.29%,n=9)。

图2 复方钩藤口服液中天麻素的色谱图Fig.1 The chromatograms of gastrodin in CUHOL 注:A:天麻素对照品;B:复方钩藤口服液; C:缺天麻阴性样品;b:天麻素。

2.3 正交试验优选复方钩藤口服液的提取工艺

按“1.2.2”项下方法进行正交试验,结果见表2、表3。

由直观分析结果可知,各因素对复方钩藤口服液中指标成分提取率影响的顺序为:A>C>D>B。由方差分析结果可知加水量和煎煮次数对口服液的提取工艺影响显著。综合结果复方钩藤口服液提取的最佳组合为A3B1C3D3,即加水量为生药材的12倍、煎煮时间2.5 h、煎煮3次、醇沉浓度为70%。

表2 正交设计表及结果Table 2 Results of the orthogonal experiment

注:综合评分=(钩藤碱含量/最大值)×50%+(天麻素含量/最大值)×50%。

2.4 工艺验证

按优化的最佳工艺制备3批样品,其口服液中钩藤碱和天麻素的含量测定结果如表4,钩藤碱、天麻素的平均含量为13.69、127.90 μg/mL。结果表明优选的制备工艺基本稳定。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

表4 复方钩藤口服液中指标成分的含量测定结果(n=3)Table 4 Determination results of indicator components in CUHOL(n=3)

表5 不同pH和温度对复方钩藤口服液澄明度的影响Table 5 Effect of different pH and temperature on the clarity and color in CUHOL

注:“+”表示口服液颜色的深浅度,“*”表示溶液中的沉淀数。

表6 口服液对小鼠体重的影响Table 6 Effect of CUHOL on body weight of

注:*表示与空白对照组比较,差异显著(P<0.05)；表6～表10同。

2.5 复方钩藤口服液制剂pH的确定

观察不同pH对口服液澄清度和色泽的影响,结果见表5。

从表5可知当pH≤5.0,口服液在不同条件下外观颜色稳定,仅有少量沉淀产生,且振摇即散,故确定口服液的pH为5.0。

另外，为了防止复方钩藤口服液制剂霉变，经过前期研究发现，用0.15%尼泊金甲酯和尼泊金乙酯等量混合具有较好的抑菌防霉效果。

2.6 复方钩藤口服液改善睡眠功能试验研究

2.6.1 小鼠体重观察 由表6可知,试验前复方钩藤口服液高、中、低三个剂量组实验小鼠的初始体重与空白对照组相比较,无显著性差异(P>0.05);经过连续30 d喂养后,各剂量组的终体重与空白对照组的比较,差异不显著(P>0.05),说明复方钩藤口服液对小鼠体重的增加无影响。

2.6.2 直接睡眠试验 由表7可知,在60 min内各剂量组中少量小鼠出现安静,嗜睡现象,但未观察得到直接睡眠现象,对照组小鼠也未出现直接睡眠现象,即复方钩藤口服液对小鼠无直接诱导睡眠作用,可进行其他改善睡眠作用的评价。

表7 口服液对小鼠的直接睡眠作用(n=10)Table 7 Effect of CUHOL on sleep-induced directly in mice(n=10)

2.6.3 延长戊巴比妥钠睡眠时间试验 由表8可知,高、中、低剂量组均明显延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间,与空白对照组比较,中、高剂量组差异具有显著性(P<0.05),说明复方钩藤口服液可协同戊巴比妥钠起到中枢镇静作用,8、16 g/kg·BW的剂量可显著延长小鼠的睡眠时间。

表8 复方钩藤口服液对延长戊巴比妥钠 诱导小鼠睡眠时间的影响(n=10)Table 8 Effect of CUHOL on prolonging pentobarbital sodium induced sleep of mice(n=10)

2.6.4 戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验 由于戊巴比妥钠通过肝酶代谢发挥作用,而对该酶有抑制作用的药物,也能延长戊巴比妥钠睡眠时间,为排除这种影响,需进行戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验,由表9可知,复方钩藤口服液高、中、低剂量组的入睡率均高于空白对照组,且随着剂量增加,小鼠入睡率也增加,三个剂量的入睡率与空白对照组相比均具有显著性差异(P<0.05),说明复方钩藤口服液具有协同阈下剂量的戊巴比妥钠显著提高小鼠入睡率的作用。

表9 口服液对戊巴比妥钠 阈下剂量催眠作用的影响(n=10)Table 9 Effect of CUHOL on subthreshold dose of pentobarbital sodium induced sleep of mice(n=10)

2.6.5 巴比妥钠睡眠潜伏期实验 由表10可见,复方钩藤口服液高、中、低剂量组与空白对照组比较,小鼠睡眠潜伏期均缩短,且与空白对照组比较,高、中、低三个剂量组均有显著性差异(P<0.05)。说明复方钩藤口服液能协同巴比妥钠缩短小鼠的睡眠潜伏期,促进小鼠入睡的作用。

表10 复方钩藤口服液对巴比妥钠 睡眠潜伏期的影响(n=10)Table 10 The effect of CUHOL on barbital sodium induced sleep latency of mice(n=10)

3 讨论与结论

复方钩藤口服液中钩藤、天麻、酸枣仁、远志均具有镇静安神或催眠之功效,文献研究结果表明,钩藤用药剂量为12 g/kg·BW时,可使小鼠自发活动减少,使戊巴比妥钠阈下睡眠剂量致小鼠入睡个数增多,并延长戊巴比妥钠阈下剂量睡眠时间[19];天麻的镇静催眠作用已被大量实验研究证实,其作用强度与天麻素含量有一定的相关性[20];酸枣仁粉剂中剂量为1 g/kg·BW时即可显著延长小鼠戊巴比妥钠睡眠时间以及提高戊巴比妥钠阈下催眠剂量诱导的小鼠睡眠发生率[21];而远志的安神功效表现在药物剂量为1 g/kg·BW时可减少小鼠自发活动,延长戊巴比妥钠阈下催眠剂量诱导的小鼠睡眠时间[22]。由此可见,各味药材或提取物单一使用时均有较好改善睡眠的功能,但将其进行配伍后在改善睡眠作用方面的研究未见有报道。因此本文将上述各药材进行合理优化组方后制备成便于服用的口服液制剂,并采用直接睡眠实验、延长戊巴比妥钠睡眠时间试验、巴比妥钠睡眠潜伏期试验、戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验,对复方钩藤口服液改善小鼠睡眠的作用进行了研究。研究结果表明,口服液中各药材的起效剂量均低于单一使用时的剂量,提高了口服液使用的安全性,复方钩藤口服液高、中、低三个剂量组对小鼠无直接睡眠作用,不仅能明显延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间,也能协同阈下剂量的戊巴比妥钠提高小鼠的入睡率,且可协同巴比妥钠显著(P<0.05)缩短小鼠的睡眠潜伏期,提示复方钩藤口服液具有改善睡眠的作用。