针刀治疗慢性软组织损伤大鼠模型的作用机制

洪汉刚, 张 凯, 刘振峰, 艾力江·阿斯拉, 邓迎杰, 方 锐, 孟庆才

(新疆医科大学附属中医医院骨二科， 乌鲁木齐 830011)

针刀治疗是中医治疗慢性软组织损伤疾病的有效和特色疗法，由于慢性软组织损伤的病因和病理机制模糊，所以对慢性软组织损伤的治疗就成为治疗学上一个难题[1-3]。而针刀作用机制的阐明已成为其发展过程中亟待解决的问题之一[4-5]。并且之前对慢性软组织损伤疾病的范围认识不足，慢性软组织损伤疾病不仅是指以上这些组织器官受到损害而导致的疾病，还包括内脏器官以及与其相连的神经、血管、韧带、筋膜、大脑、小脑、延髓、脊髓等[6-7]。结合国内外关于慢性软组织损伤修复的最新研究结果及本课题组前期的研究基础，课题组推测针刀治疗慢性软组织损伤时通过启动自身的修复系统，借助血小板衍生与激发产生的多种生长因子如血小板衍生因子(PDGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、促生长因子C(IGF-I)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等在病变组织局部集聚，这些生长因子进而促进了慢性损伤软组织的修复及愈合。因此本研究通过建立大鼠慢性软组织损伤模型，并借助组织形态学、Western-blot等分子生物学技术从“针刀治疗—微循环—血小板—生长因子—组织修复”的角度来探索和阐释针刀的作用机制。本研究从一定程度上可为研究针刀的作用机制提供新的研究角度，为指导临床及提高疗效提供理论依据，对诠释和发展祖国的针刀理论起到一定的补充与完善作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器采用2个月龄的SPF级SD雄性大鼠共计80只，平均体质量(250±50)g，均由新疆医科大学实验动物中心提供。

1.2 主要实验试剂及材料BCA Protein Assay Kit、RIPA裂解液、组织蛋白抽提试剂、蛋白磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、Pierce Rabbit Anti-Mouse IgG，(H+L),Peroxidase Conjugated、Pierce Goat Anti-Rabbit IgG，(H+L),Peroxidase Conjugated、蛋白预染Marker、β-巯基乙醇、SDS、Tris、丙烯酰胺、N,N′-亚甲双丙烯酰胺、PVDF Transfer Membrane (0.45 μm)、Glycine、Tween 20、SuperSignal West Prico Chemiluminescent Substrate

实验所用0.8 mm刀口针刀为北京卓越华友医疗器械有限公司的汉章牌针刀。医疗器械许可证：北京药监局器械生产许可号2008008，产品注册号：京药监械(准)字：2009第2270270号，执行标准：YZB/京0977-2007。

1.3 造模方法在慢性软组织损伤大鼠模型中，采用机械冲击挫伤法，将大鼠右后肢置于膝关节伸展和背屈90°位置。损伤部位是大鼠跟腱和腓肠肌的软组织部位。撞针质量335 g，从80 cm高度垂直下落，动能2.63 J，撞针面积2 cm2，损伤部位皮肤完整。冲击后，单侧后肢肉眼可见瘀伤部位、血瘀、肿胀，表示模型成功。部分皮肤损伤和检查显示骨折的迹象被排除在外。未治疗大鼠右下肢急性软组织损伤后，正常饲养，半个月后形成慢性软组织损伤动物模型。

1.4 动物分组与干预比较方法

1.4.1 动物分组 造模后采用随机数表法将实验动物随机分为4组，即：模型组、电刀组、针刀组和对照组，每组20只，共80只。

1.4.2 干预方式 操作前先将大鼠根部作局部无菌消毒，即先用酒精消毒，再用碘酒消毒，酒精脱碘。戴无菌手套，确认进针部位，并做以标记，然后采用0.4 mm刀口针刀顺肌纤维及肌腱分布方向做铲剥，也就是说，将针刀的尖端压在要剥离的组织上，使其前进和后退，从而分离横向粘附的组织纤维。每只大鼠的进针部位相同，均为大鼠右下肢跟腱上方0.5 cm处，统一做铲剥分离手法6次。针刀组：操作前先将大鼠根部作局部无菌消毒，即先用酒精消毒，再用碘酒消毒，酒精脱碘。戴无菌手套，确认进针部位，并做以标记，然后采用0.8 mm刀口针刀顺肌纤维及肌腱分布方向做铲剥。每只大鼠的进针部位相同，均为大鼠右下肢跟腱上方0.5 cm处，同时采用针刀进行操作的手法一致，统一做铲剥分离手法6次，针刀治疗由有临床操作经验的主治大夫进行操作。电刀组：方法同普通针刀。

1.4.3 比较方法 6天时模型组与对照组比较；电刀组与模型组比较；针刀组与模型组比较，电刀组与针刀组比较(确定不同针刀的治疗效果)。12天时按上述方法进行比较。

1.5 实验动物取材在采用针刀治疗后，于第6天、第12天分批分组处死实验大鼠，将其跟腱及附带的腓肠肌组织完整取下，长度为2 cm。

1.6 组织形态学观察(1)染色；(2)肉眼观察；切片上有两块标本，长条形的为纵行切面，椭圆形的为横切面；先观察纵行切面，骨骼肌组织纵切面。

1.7 Western-blot实验(1)蛋白样品制备：单层贴壁细胞总蛋白的提取,组织中总蛋白的提取,加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取；(2)蛋白含量的测定：制作标准曲线,检测样品蛋白含量；(3)SDS-PAGE电泳：清洗玻璃板,灌胶与上样,电泳；(4)转膜：将切好的7.3～8.6 cm硝酸纤维素膜置于水上浸2 h使用,电转移一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h,转完后将膜用1×丽春红染液染5 min,然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 950免疫反应：将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。将一抗用TBST稀释至适当浓度。室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗1次，10 min，进行化学发光反应。(6)化学发光、显影、定影：将A和B2种试剂在保鲜膜上等体积混合；将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。(7)凝胶图象分析：将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。

2 结果

2.1 HE染色结果对照组大鼠肌肉组织排列较为紧密，一般呈现多角形，大小一致，排列均匀，组织结构完成，无渗出、出血以及组织肌肉萎缩等现象。慢性软组织损伤模型组HE染色可见大鼠损伤组织肌纤维有明显萎缩，可见少许陈旧性出血以及巨噬细胞等浸润。针刀组与电刀组大鼠损伤肌肉组织修复现象在第12天时较为明显(图1)，与模型组比较可见肌纤维排列整齐，肌纤维萎缩情况减轻，肌纤维组织中可见大量细胞浸润，明显多于对照组及模型组。

A: 对照组(HE×400)

B： 模型组(HE×200)

C： 电刀组(HE×200)

D： 针刀组(HE×200)

图1 不同分组SD大鼠慢性软组织损伤HE染色结果

2.2 TGF-β及VEGF蛋白表达量检测针刀组TGF-β蛋白的表达量在第6天时均高于其他各组，在第12天时除了模型组TGF-β蛋白表达量有所上升外其余3组变化不明显；针刀组血管内皮生长因子VEGF的表达量在第6天时明显高于其他3组，差异有统计学意义(P<0.05)，在第12天时针刀组VEGF的表达量仍然明显高于其他组(如图2、3)。

注：C为对照组； M为模型组； D为电刀组； Z为针刀组。

图3 不同分组SD大鼠慢性软组织损伤组织中TGF-β蛋白表达量

3 讨论

针刀医学是在中医基础理论指导下，吸收现代科技成果，包括西方医学的新成果，形成的一个新的医学理论体系；经过30年的发展，形成了一套完整的理论体系，是中医在基本理论方面实现现代化的成功范例之一[8]。然而其作用机制至今未被阐明，尚处于各种假说阶段，致使不同学派之间存在争议[9-10]。因此，深入探讨针刀的作用机理，是针刀医学新理论、新技术、新仪器发明的理论基础。它也是针刀医学认识、发展和应用的关键。近年来电动针刀临床运用广泛，其操作较普通针刀来说，运用的是筋膜理论，操作简单、安全，效果显著，即使没有任何基础的医师短时间内可以熟练掌握。而普通针刀需要医师熟练的操作技术及临床经验。

国外学者Park等[11]通过给肌腱损伤的大鼠局部注射血小板浓缩液后发现此种方法可以促进受损的肌腱修复愈合； Peerbooms等[12]学者通过随机双盲临床试验证明通过给肱骨外上髁炎局部注射自体富含血小板的血浆(PRP)后可收到明显的临床效果，与局部封闭疗法比较此方法效果更佳，疗效更持久。此外，自体富含血小板的血浆局部注射法在其它种类软组织损伤疾病、骨愈合、肌腱再生等领域进一步得到验证和更大范围的应用。Ahmad等[13]认为一定量的血小板在病变组织局部释放后会激发及产生多种如PGF、TGF-α、TGF-β、IGF-I、VEGF、PDGF、bFGF生长因子，这些生长因子会促进或加速慢性损伤部位修复及愈合，而且这些生长因子的表达量在很长时间内都维持在较高的水平。本研究通过组织形态学HE染色观察发现针刀治疗组大鼠损伤肌肉组织修复与其他组比较有差异，第12天时差异最为显著，针刀组之间差异不明显；Western-blot检测结果显示第6天时针刀组TGF-β及VEGF蛋白表达量明显高于其他组(P<0.05)，第12天时各组TGF-β及VEGF蛋白表达量均有所下降，但是针刀组2种生长因子的表达量处于相对较高水平，这一现象与文献的观点总体上相符。

本研究证明：在损伤后不同的时间点，VEGF和TGF-β有不同的程度的表达，随着损伤后时间的延长，含量逐渐呈下降趋势。本研究证明：针刀治疗可显著提高损伤组织内的VEGF和TGF-β含量，加速组织内血管密度，提高局部血液循环，更加有利于组织恢复。可能是由于针刀导致局部机械性损伤治疗效应引起局部病变组织内组织进一步出现损伤，加重了局部病变反应，同时又促进了组织修复。本研究提示：对损伤组织进行针刀治疗，光镜下观察显示组织细胞易发生变性坏死，引起炎性细胞浸润等。本实验研究证明的针刀治疗可提高组织内VEGF和TGF-β含量，提高局部血流量等结果相一致。

人体是一个自我修复能力强的机体,因此在进行治疗时不可滥用各种治疗方法。建议医生的治疗是调整人体的各种病理变化，使之自我修复。在能力范围内，正确掌握各种治疗的适应证，不能采用各种过度治疗方法，造成人体不可逆后遗症[14]。人体的自我调节功能具有积极意义，它不仅能抑制和减轻人体的病理变化，而且能预防致病因素，维持人体生理功能的正常功能，在调节这种抵抗的过程中产生新的疾病。产生新疾病的因素对认识和发现许多严重疾病的发病机制和治疗具有重要的指导意义。

综上所述，针刀可用于治疗慢性软组织损伤是有一定促进作用，能够提高大鼠损伤既然组织中TGF-β及VEGF蛋白表达量，促进组织恢复。本研究仅是初步探讨，尚需要更深入的研究进行阐释和验证。