微生物降解角蛋白机制及角蛋白酶应用研究进展

张 荣 ，凌晓宁 ，李昆太

（1. 江西农业大学 生物科学与工程学院，江西 南昌 330045；2. 广东海洋大学 食品科技学院，广东 湛江 524088）

近年来，由于全球人口增多伴随着禽肉制品的大量消费，家禽业产生的羽毛废弃物越来越多，根据Alltech 全球饲料调查，2018年肉鸡饲料产量为 3 亿 t，估计可生产约 2 亿 t 鸡肉和 1000 多万 t 鸡毛[1]。这不仅仅会浪费大量的蛋白质资源，而且还会引起各种各样环境方面的问题，进而危害人体健康。角蛋白废弃物作为可再生利用的生物资源，可以作为不同领域的使用材料。如羽毛富含氨基酸，是肥料和饲料的宝贵来源[2]。已有研究结果表明，大量细菌和真菌通过分泌角蛋白酶来降解羽毛，可以将羽毛转化为生物肥料和动物饲料等增值产品应用于家禽工业，既能降低了成本又能保护环境[3]。由于羽毛的结构稳定，在未适当处理的情况下被释放到环境中，容易成为污染源之一[4]。未经处理的羽毛会使多种致病微生物排放各种污染物，如氧化亚氮、氨气和硫化氢，严重污染环境和危害人类的健康。因此，如何合理处理和利用羽毛引起人们的广泛关注。 本文着重介绍了微生物降解角蛋白机制研究及角蛋白酶的应用，为今后角蛋白酶研究打下坚实的基础。

1 角蛋白的结构

角蛋白作为一种难降解的结构蛋白，是继纤维素和几丁质之后的第三类聚合物[5]。根据蛋白质二级结构差异可以分为 α-角蛋白和 β-角蛋白[6-7]。一般情况下，动物毛发中的角蛋白为 α-角蛋白，具有 α-螺旋结构，直径为 7～10 nm，分子量在 40～60 ku [8]，家禽羽毛、蹄和角中的角蛋白为 β-角蛋白，其结构为 β-折叠[9]，二硫键含量较高[10]，直径为 3～4 nm，其分子质量在 10～12 ku [10-11]。α-螺旋和 β-折叠会以多种形式结合，形成角蛋白的超螺旋结构，再加上二硫键、疏水键和氢键等键的强相互作用，导致角蛋白分子结构十分稳定，不容易被降解[12-14]。

2 角蛋白的加工工艺研究

角蛋白具有较高的经济利用价值，但其分子结构十分稳定，不容易被常规方式降解。目前，降解角蛋白的方法主要有物理、化学和生物降解法[15]。

2.1 物理法

物理降解法主要分为高温水解法和膨化法。在饲料生产中经常使用高温水解法降解角蛋白，首先是把羽毛清洗干净、晒干，并放置在高压锅内，在高温高压的处理下，使其干燥、粉碎，最后过筛，就得到羽毛粉。在该流程中控制好温度、压力和时间等条件，可以有效保证羽毛粉的营养价值，但大多数情况下只能得到分子量较低的蛋白和多肽混合物，并且会破坏产品中的甲硫氨酸、赖氨酸和色氨酸等氨基酸的结构[16-17]。

膨化法是对羽毛进行切割、挤压、加热，使其熔化，并立即将其降低到常温常压，从而破坏角蛋白的结构，获得最终产品。虽然该方法操作简单，但在膨化过程过程中温度和压力的剧烈变化，容易破坏二硫键，降低半胱氨酸含量，且成本高、能耗高，在实际生活中应用不广泛[18]。

2.2 化学法

化学降解法是指加入化学试剂使角蛋白分子中的氢键、二硫键断开，角蛋白分子的二级结构被破坏，将不可溶的角蛋白分解为可溶的多汰、氨基酸组分。化学降解法主要分为酸水解和碱水解。

酸水解法是将蛋白质和酸混合后加热水解，破坏角蛋白中二硫键和肽键，使角蛋白释放氨基酸，最终得到氨基酸产物的方法，主要应用于饲料和氨基酸工业生产中[19]。碱水解法一般使用氢氧化钠、氢氧化钙等强碱试剂破坏角蛋白结构后得到氨基酸溶液[20]。 碱水解法导致胱氨酸、半胱氨酸和精氨酸的损失，并将 L-氨基酸转化为 D-氨基酸，这些氨基酸不能被动物消化。化学降解法不仅会破坏角蛋白中的部分氨基酸，还会产生大量的工业废水，而且处理工艺复杂，生产成本高，在实际操作中有一定的局限性[21]。

2.3 生物降解法

利用微生物产生的角蛋白酶在温和条件下对角蛋白废弃物进行处理，成为近年来一种高效、低能耗和环保的降解方式[17]。生物降解法分为酶法和微生物降解法。

酶法是利用角蛋白酶将角蛋白废弃物水解成许多短肽，得到最终产品的一种方法。该方法操作条件温和、绿色环保、产品消化率高、稳定性好，但成本较高，在实际生活中应用不广泛[7]。

微生物降解法是通过某些微生物发酵产生角蛋白酶作用于角蛋白，从而得到降解产物的方法。与物理和化学方法相比不仅反应条件温和，角蛋白的营养价值损失较小、氨基酸的利用率增高，而且不会产生大量废弃污染物。与酶法相比不仅成本低，而且还能产生多种营养物质[22]。与理化方法相比，反应条件温和，角蛋白营养价值损失小，氨基酸利用率提高，没有产生大量的废污染物。与酶法比较不仅成本低，而且能产生多种营养素[22]。

3 微生物降解角蛋白机制研究

迄今为止，微生物产生的角蛋白酶降解角蛋白的机制尚未建立。一般认为，随着微生物的生长和代谢，角蛋白逐渐被降解为氨基酸、肽和能量等物质[23]。该过程包括 3个基本步骤：变性、分解和转氨基作用[24]。

3.1 变性：破坏二硫键

角蛋白中含有大量不易变性的二硫键，因此，为了降解角蛋白，应首先破坏这些二硫键，以松开角蛋白的结构 [25]。目前对二硫键破坏机理的研究可归纳为 4种类型：生物膜电位 [26]、机械压力 [27]、硫分解[28]和酶解理论[29]。

3.1.1 生物膜电位理论生物膜电位理论认为，细菌对角蛋白的分解可以通过其表面的膜结合氧化还原系统进行，该氧化还原系统含有二硫键还原酶和 NADH 生产系统。 NADH 生产系统可以提供持续的还原力来打开二硫键，维持细胞氧化还原平衡，促进角蛋白降解。Ramnani 等[30]发现，角蛋白酶和具有二硫化物还原活性的细胞内可溶性物质都不能完全降解羽毛，而活细胞的存在对降解非常重要。在降解过程中，细胞粘附在羽毛表面，由于细胞分泌的还原剂不断供应，使角蛋白不断降解，说明活细胞与羽毛的接触有利于降解。

生物膜电位理论依赖于活细胞的活性来产生无限的还原能力来破坏二硫键，因为细胞外分泌的角蛋白酶或角蛋白酶加上其他细胞内还原物质不能有效地自行降解角蛋白[31]。然而，目前对这一理论的研究还比较少，研究人员很难确定二硫键是如何被还原的。

3.1.2 机械（物理）压力理论机械压力现象通常发生在能够产生菌丝体的微生物中。菌丝生长会产生机械效应，切割角蛋白分子，暴露角蛋白分子的内部结构，有利于更好地发挥角蛋白的作用 [32]。虽然菌丝生长所带来的机械压力是破坏角蛋白致密结构的主要力量，但角蛋白的溶解是角蛋白酶作用的结果 [33]。

在某些角蛋白降解真菌中，菌丝体的机械破坏发生在角蛋白酶产生之前，菌丝体的生长速度与角蛋白的降解程度呈正比。因此，菌丝聚集产生的压力和生长过程中产生的渗透效应被认为是角蛋白降解机制的物理效应[34]。

3.1.3 硫解作用理论二硫键维持角蛋白的稳定，它的断裂有利于角蛋白降解，需要碱性环境或还原剂才能破坏二硫键[35]。如化学还原剂或生物酶，其功能与二硫化物还原酶相似。硫解理论涉及微生物在新陈代谢过程中分泌亚硫酸盐，打破角蛋白二硫键，导致蛋白质变性。在微生物降解羽毛的早期阶段，可以检测到含有巯基和巯基半胱氨酸残基的肽。随着降解过程的进行，降解液中亚硫酸盐和硫醇化合物的含量会逐渐降低，而硫酸盐含量会逐渐增加[36]。由于角蛋白降解过程中大量二硫键的破坏，在角蛋白降解微生物中发现了高浓度的半胱氨酸。因为高浓度的半胱氨酸对细胞有毒，降解角蛋白的微生物必须能够平衡半胱氨酸水平[37]，微生物会将半胱氨酸转化为亚硫酸盐，进而促进角蛋白酶活性和角蛋白降解。

3.1.4 复合酶理论利用蛋白质工程技术，研究人员从角蛋白水解液中分离、纯化出不同种类的角蛋白酶。但发现角蛋白不能被纯角蛋白酶水解，除非存在二硫键还原酶或类似的还原力[38]。因此，二硫键还原酶在角蛋白的降解过程中起着决定性的作用，而角蛋白在整个降解过程中是不可缺失的，需要不断的分泌[39]。角蛋白酶是一种复合酶，包括二硫还原酶、肽酶和水解酶，角蛋白中的二硫键被二硫键还原酶还原，还原后的角蛋白被角蛋白酶进一步水解成短肽或氨基酸等物质。

3.2 水解作用：角蛋白酶水解

当角蛋白的致密结构被破坏时，通过各种变性方法，角蛋白降解菌株开始分泌角蛋白酶进一步降解松散的角蛋白，将结构被破坏的多肽链进一步水解成小分子多肽甚至氨基酸小分子。角蛋白酶是一种特异降解角蛋白的蛋白水解酶，这意味着它比其他蛋白酶对角蛋白底物更敏感。 角蛋白酶具有广泛的底物，能完全溶解许多可溶性和不溶性蛋白质，如酪蛋白、血红蛋白、胶原蛋白、球蛋白、羊毛和羽毛[40]。水解过程受温度、pH 值、还原剂、金属离子和酶抑制剂等多种因素的影响。 此外，大多数角蛋白酶在 40～60 ℃和中性至碱性 pH 下显示出最佳活性，很少是酸性蛋白酶。

3.3 转氨基作用

小分子多肽氨基和氨基酸小分子在转氨基反应的作用下完全水解，生成硫化物和铵盐或氨气。由于转氨基作用和二硫键还原释放的硫巯基的存在，大多数角蛋白酶释放大量的铵盐，从而增加溶液的碱度[40]，能够降解角蛋白的微生物菌株正在不断开发中[41]。然而，这些微生物降解角蛋白的机理尚未完全阐明，严重阻碍了角蛋白废弃物的可持续利用，因此，需要广大学者进一步研究。

4 角蛋白酶的应用

4.1 角蛋白酶在制革工业中的应用

在制革工业中，传统制造皮革的方法是使用石灰、含硫化合物和其它直接脱毛剂，化学脱毛工艺会产生大量有毒废物，污染水，土壤和大气，并导致严重的人类健康问题。每公斤皮革加工使用约 35～40 L的水，该过程不仅会产生大量废水废气，造成巨大的水污染和浪费，还会造成皮革质量受损[42]。角蛋白酶在制革过程中的应用，取代了传统的化学物质，不仅具有降低皮革成本、节能、环保、提高皮革质量的优点，而且可以使毛皮中的胶原蛋白变得松散，使皮革更加柔软舒适[43]。从Bacillus cereusandPseudomonassp.提取的角蛋白酶不仅可以提供更好的脱毛效果，而且可以提供更好的皮革质量[44]。Kalaikumari 等[45]利用Bacillus paralicheniformisMKU3 菌株产的角蛋白酶加入到脱毛过程中，脱毛效果明显，是突出的皮革脱毛剂，其对皮革没有损害作用。

此外，酶促脱毛可最大程度地减少制革厂常用的有害化学物质（硫化物，石灰和胺）的依赖，通过降解家禽粪羽毛产生的角蛋白酶可以成为皮革行业化学脱毛的替代方法，从而可以通过生物修复防止环境污染。

4.2 角蛋白酶在饲料和肥料中的应用

含有硫和氨基酸的有机肥料已被公认能促进植物的新陈代谢。鉴于这一事实，角蛋白水解物是一种廉价的蛋白质，含有这些成分，使它们成为有前途的生物肥料。将角蛋白废弃物进行农业堆肥，利用微生物使氮肥缓慢释放，可以作为丰富的氮源补充剂来支持植物生长，改善土壤质地[46]。Pseudomonas otitisH11 可以产生寡肽和各种氨基酸，富含寡肽的水解产物可以用作功能性寡肽提取的来源，也可以用作功能性饲料补充剂[47]。金杆菌属产生的角蛋白酶用于改善香蕉植株中的氮，促进植物的根和芽的生长[48]。羽毛分解产生的角蛋白酶具有切割 β-角蛋白结构的亲和力，因此可以降解 β-折叠密度大的朊蛋白，消除饲料中的朊蛋白污染，用于生产安全的饲料，在一定程度上缓解动物饲料蛋白供求的紧张形势[49]。

4.3 角蛋白酶在洗涤剂中的应用

研究表明，角蛋白酶具有使洗涤剂稳定的特性以及对不同污渍具有清洁能力[50]。Bacillus aeriusNSMk2 所产的角蛋白酶显示出对盐度的出色稳定性，并且被发现与大多数商业洗涤剂兼容，可以有效去除衣服上的巧克力，血液和蛋清蛋白污渍[51]。芽孢杆菌 TKB2 产生的角蛋白酶作为添加剂加入到洗涤剂中，可提高其去污能力，并且不会破坏衣物，产生的洗涤废水不会污染环境[52]。除了用于洗涤剂外，角蛋白酶还用做排水沟清洁剂中的添加剂[53]。角蛋白酶除了用于清洁剂外，还用作下水道清洁剂中的添加剂[53]。含磷洗涤剂废水流入河道，导致水体磷含量增加，水质富营养化，藻类大量生长，破坏正常生态平衡。因此，使用含角蛋白酶的洗涤剂，对环境影响小，效率高，是未来的发展趋势[54]。

4.4 角蛋白酶在医药和化妆品中的应用

以角蛋白酶为基础的药物治疗痤疮具有很高的疗效，痤疮通常表现为皮肤中的皮脂腺感染，造成这种情况的主要原因是角质形成过多阻塞了皮脂腺，导致出现红色丘疹，主要发生在青少年中。一些药物已经在治疗痤疮的疗法中推出了温和的酶促剥离或活性佐剂。在全球范围内，患有指甲疾病的患者，往往需要长时间的治疗，并面临一个重大的问题——复发。使用角蛋白酶可以分解甲盖的角蛋白，从而使甲盖松动，增强药物的渗透性[55]。来自Paecilomyces marquandii产的角蛋白酶被证明可以破坏甲盖并增强药物渗透性[56]。

角蛋白酶可以祛除皮肤外层的角质，帮助化妆品中的活性成分更容易进入皮肤深层，作用于皮肤深层细胞。角蛋白酶降解的角蛋白主要是氨基酸和多肽，使皮肤吸收营养物质。角蛋白水解物也可用于洗发水和着色剂等护发产品中，以防止化学和环境对头发的损害，提高头发质量[57]。还可以用角蛋白酶代替常用于脱毛膏中的巯基乙酸盐，生物脱毛剂具有显著的脱毛效果，与市售脱毛膏相比，生物脱毛剂显示出角蛋白酶在化妆品行业的独特用途。

5 小结与展望

羽毛废弃物是自然界中蛋白质含量最高的资源，其利用率很低。应用角蛋白酶降解角蛋白处理成本较低、产品更高效、稳定、生物转化作为一种低成本、环境友好的工艺被广泛接受，具有巨大的发展潜力和空间。有关角蛋白酶的研究越来越多，它们新的潜在应用也不断被开发。随着科学技术的发展和对蛋白质需求的增加，对角蛋白酶降解的机理和方法的研究越来越深入，角蛋白资源的广泛应用，不仅可以缓解我国蛋白质饲料资源的短缺，而且可以改善羽毛废弃物对环境的污染，具有重要的现实意义和战略意义。