MTB特异性细胞免疫反应试剂盒检测活动性肺结核患者出现假阴性的危险因素分析

龚道方 刘彬彬 万小洁 余艳艳 谭云洪

结核病是一种造成高死亡率和发病率的主要全球性传染病，世界卫生组织估计，全世界每年有124万例死亡和1000万例新发患者[1]。对活动性肺结核的快速诊断和治疗是发展中国家结核病控制规划的基础。结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应(QuantiFERON-TB gold In-Tube，QFT-GIT)检测试剂盒是用于诊断结核分枝杆菌感染的第三代全血酶联免疫吸附测定方法，系统回顾和荟萃分析发现，该方法对活动性肺结核患者检测的敏感度为81%～92%[2]；可见，QFT-GIT检测会产生一定比例的假阴性结果，将影响QFT-GIT假阴性活动性肺结核患者的发现和诊断。笔者以2018年7—10月间于湖南省胸科医院住院并确诊的活动性肺结核患者作为研究对象，对产生QFT-GIT检测结果假阴性的可能影响因素进行筛选与分析，以期提高QFT-GIT试验在活动性肺结核中的诊断价值。

对象和方法

一、 研究对象

收集2018年7—10月间于湖南省胸科医院住院并通过病史、临床症状、体征、影像学、细菌学、病理、诊断性治疗等手段单独或联合确诊的1287例活动性肺结核患者作为研究对象，根据排除标准剔除无QFT-GIT检测结果患者168例、年龄小于18岁者31例、HIV阳性患者6例、患免疫系统疾病10例，最终纳入1072例。1072例研究对象中包括男736例，女336例，年龄范围18～92岁,平均(44.27±18.40)岁。初治患者851例(79.4%)，复治患者221例(20.6%)，痰涂片阳性116例(10.8%)，痰培养阳性269例(25.1%)，肺结核并发糖尿病85例(7.9%)，肺结核并发肺外结核136例(12.7%)，其中淋巴结结核58例、骨关节结核31例、肠结核12例、肾结核11例、结核性盆腔炎8例、结核性腹膜炎7例、结核性脑膜炎5例、结核性心包炎4例。

二、纳入和排除标准

活动性肺结核的诊断参照中华医学会结核病学分会编著的《临床诊疗指南：结核病分册》[3]。排除标准：(1)无QFT-GIT检测结果者；(2)年龄<18岁者；(3)HIV感染者；(4)患免疫系统疾病者。

三、研究方法

1.标本采集与处理：采集患者外周静脉全血4～6 ml置肝素锂抗凝管中，18～25 ℃保存，并于16 h内送至实验室。然后，将标本分置于促有丝分裂因子(mitogen)管、结核抗原(TBAg)管和空白对照(Nil)管，每管1 ml，立即摇匀，37 ℃孵育16～24 h，3000×g离心15 min，取出血浆。

2.检测血浆中γ干扰素(IFN-γ)释放量及结果判读：3000×g离心15 min，分别取3管培养后上清液进行酶联免疫吸附法检测，读取吸光度值，用Cellestis公司提供的QFT-GIT分析软件计算血浆中IFN-γ的浓度。

四、试剂和仪器

QFT-GIT试剂盒(澳大利亚Cellestis有限公司产品)，恒温培养箱(上海博讯医疗生物股份有限公司产品)，Thermo Multifuge X1R离心机 (美国Thermo公司产品)，HY-3振荡器(常州国华电器有限公司产品)，imark酶标仪 (美国伯乐公司产品)。

五、 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计数资料的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。多因素分析采用logistic逐步回归，以患者QFT-GIT结果为因变量，以患者临床特征为自变量，将所有自变量纳入多因素模型，筛选出差异有统计学意义的因素。变量赋值表如表1所示。

表1 变量赋值表

结 果

一、QFT-GIT检测假阴性结果相关的单因素分析

1072例研究对象中，QFT-GIT假阴性结果占17.5%(188/1072)。单因素分析显示年龄≥40岁、吸烟史、患者类型、病程、结核类型、痰培养结果、白蛋白及淋巴细胞计数与QFT-GIT假阴性结果存在显著相关(表2)。

二、与QFT-GIT假阴性结果相关的多因素logistic 回归分析

年龄≥40岁、复治患者、肺结核并发肺外结核、痰培养阴性、白蛋白<35 g/L及淋巴细胞计数<0.6×109/L是造成QFT-GIT假阴性结果的影响因素，OR值分别为1.972、2.782、1.741、2.043、3.354、2.777、3.662(表3)。

讨 论

目前，许多学者对QFT-GIT用于诊断结核病的敏感度、特异度、阴性预测值及阳性预测值指标做了评估，而对QFT-GIT假阴性影响因素的相关研究较少[4]。本研究的QFT-GIT假阴性总发生率为17.5%，在文献报道的5%～20%发生率内[5-6]。

表2 1072例活动性肺结核患者采用QFT-GIT检测造成假阴性的单因素分析

续表2

表3 1072例活动性肺结核患者QFT-GIT检测产生假阴性的多因素logistic回归分析

本研究采用多因素logistic回归分析，发现在活动性肺结核患者中年龄≥40岁、复治、肺结核并发肺外结核、痰培养阴性、白蛋白<35 g/L及淋巴细胞计数<0.6×109/L是QFT-GIT试验产生假阴性结果的影响因素。随着年龄的增长，QFT-GIT检测结果的假阴性率会逐渐升高，与国外相关文献报道结论相似[7-8]。分析原因可能是随着年龄的增长，机体免疫能力相对下降，淋巴细胞的生物学能力也随之下降[9]。活动性肺结核是一种依赖于淋巴细胞的免疫反应，当人体免疫水平下降时，结核抗原刺激不能产生有效免疫应答；因此随着年龄增长，淋巴细胞对结核分枝杆菌特异性抗原的免疫应答能力下降是导致QFT-GIT检测结核病的敏感度降低的主要原因。在中国，老龄化是一个突出问题，老年结核病的发病率明显高于年轻人，而且老年人常伴随其他疾病，结核病病情往往更复杂。因此，迫切需要一种准确、敏感诊断老年结核病的方法。

本研究发现复治患者与QFT-GIT检测产生假阴性显著相关。有研究表明，QFT-TB检测结果为阴性较阳性的肺结核患者病情更复杂，而且QFT-TB检测的敏感度可能因病情复杂程度的不同而存在差异[10]。因此笔者推测，由于复治患者病情更复杂，从而降低了QFT-GIT检测结核病患者的敏感度。本研究因复治患者样本量不够大，该类患者对QFT-GIT检测结果产生假阴性的影响应在大样本量的活动性肺结核患者中做进一步分析。邹兴武等[11]研究报道肺结核并发肺外结核是γ干扰素释放试验(IGRA)产生假阴性的影响因素，本研究与其报道一致。因此，在肺结核并发肺外结核时QFT-GIT检测结果为阴性不能够排除活动性结核病。然而，Nguyen等[12]的研究显示，肺结核并发肺外结核与QFT-TB检测产生假阴性结果没有相关性，原因可能是不同研究所纳入的群体和IGRA测定方法不同所致。痰培养阴性患者因体内的结核分枝杆菌载菌量低，结核抗原特异性效应T细胞免疫应答能力随之下降甚至消失，这可能是导致QFT-GIT 检测产生假阴性结果的原因[13]。此外，Lee等[14]报道结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)阳性结果与外周血抗原载体数量密切相关。

由于淋巴细胞计数减少可降低IFN-γ的产生，因此多项研究确定淋巴细胞数量是导致IGRA检测结核病敏感度下降的主要原因[15-18]。Yang等[19]的研究也表明，CD8+T淋巴细胞减少是T-SPOT.TB检测结果产生假阴性的影响因素。本研究显示，淋巴细胞计数<0.6×109/L是造成QFT-GIT检测活动性肺结核患者产生假阴性结果的独立影响因素之一。淋巴细胞的数量能反映机体的免疫能力，当淋巴细胞总数减少或功能下降时产生相应的细胞因子也随之减少，因此淋巴细胞计数和功能下降均有可能成为QFT-GIT检测结果为阴性的影响因素。本研究还发现白蛋白<35 g/L是另一个造成QFT-GIT检测活动性肺结核患者产生假阴性结果的独立影响因素。而谭守勇等[20]研究表明，白蛋白浓度下降造成营养不良而继发免疫功能低下，特别是细胞免疫功能下降，是导致QFT-GIT检测结果产生假阴性的主要原因。这一结论为本研究结果的正确性提供了佐证。

综上所述，活动性肺结核患者中年龄≥40岁、复治、肺结核并发肺外结核、培养阴性、白蛋白<35 g/L 及淋巴细胞计数<0.6×109/L会导致QFT-GIT 检测结果的假阴性率升高，提示在临床工作中需要慎重对待QFT-GIT检测为阴性的结果。