三种实验室诊断技术对结核分枝杆菌复合群检出率及检测费用的比较研究

刘彬彬 龚道方 陈振华 郭婧玮 余艳艳 刘丰平 欧阳辉 谭云洪

2018年世界卫生组织发布的全球结核病报告提出，中国结核病诊断方面的问题之一为中国肺结核细菌学检出率低，仅为31%，远低于世界平均水平(57%)[1]。目前，市场上不断涌现出各种结核分枝杆菌复合群的检测方法并广泛应用于结核病实验室诊断领域，从其中选择一种适合不同实验室条件、准确且性价比高的检测方法尤为重要。目前，湖南省每年肺结核患者的病原学阳性检出率较低，且实验室诊断技术的普及程度不够，因此，本课题组采用前瞻性的方法，通过对结核病患者同一份痰标本同时进行液基夹层杯涂片(采用集菌法；简称“涂片法”)、L-J固体培养法(简称“L-J培养法”)和结核分枝杆菌复合群核酸检测(采用恒温扩增法；简称“恒温扩增法”)，比较3种方法对结核分枝杆菌复合群检出率的差异，为湖南省各家结核病实验室诊断技术的选择提供参考依据。

对象和方法

一、研究对象

采用随机数字表的方法，从湖南省120家结核病定点医院中抽取3家作为研究现场，分别为浏阳市人民医院、醴陵市湘东医院、桃江县人民医院。以3家医院2018年11月1日至12月31日就诊的肺结核可疑症状者(咳嗽、咳痰2周及以上或痰中带血)为研究对象，根据临床症状、胸部X线摄片及实验室检查项目结果，并依据《WS 288—2017 肺结核诊断》[2]的标准对肺结核患者进行诊断。3家医院入选患者共636例，剔除未留取标本的患者，最终628例患者纳入本研究。其中，男463例(73.7%)，女165例(26.3%)；年龄6～94岁，平均年龄(59.4±15.2)岁。

二、研究方法与内容

采用配对设计的方法，即一份痰标本同时进行涂片法、L-J培养法和恒温扩增法进行检测，再进行比较，具体方法如下。

1.标本留取及L-J固体培养：每例患者用痰液收集瓶收集3～5 ml痰标本(可多次留)，首先采用4%的氢氧化钠溶液对痰标本进行充分液化，静置15 min后用无菌滴管取0.1 ml接种到酸性罗氏培养基上(接种2管)，同时将剩余的液化标本送至分子生物检测室。每周观察1次培养基，发现菌落生长后，将阳性菌株送至湖南省参比实验室，由专门的工作人员挑取菌落完成涂片，菌落经抗酸染色镜检呈阳性者报告培养阳性；2个月未见菌落生长报告培养阴性。同一例患者的2管接种标本中，任何一管发现抗酸杆菌生长即判定为L-J培养阳性。

2. 恒温扩增法：吸取培养后剩余的充分液化的痰标本1 ml加入带旋盖的离心管中(同时将剩余的液化痰标本送至液基涂片室)，以离心半径40 cm，12 000 r/min离心5 min，弃上清液。再加入生理盐水1 ml，混匀，以离心半径40 cm，12 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入100 μl的DNA提取液，100 ℃ 加热10 min，加热后迅速冷却(置于-20 ℃冰箱)10 min，以离心半径40 cm，12 000 r/min 离心2 min，将上清液加入含有混匀试剂的PCR管中，盖好管盖，以离心半径40 cm，10 000 r/min 离心5 s，立即进行扩增反应；反应程序：63 ℃，反应时间45 min(恒温扩增荧光检测仪型号：Deaou-308C)。结果判读标准为：若扩增曲线呈“S”型，检测结果为阳性，即含有结核分枝杆菌复合群；如果扩增曲线不呈“S”型，是一条直线或倾斜的直线，检测结果为阴性，即不含结核分枝杆菌复合群。

3. 涂片法：将剩余的所有充分液化的痰标本转入液基夹层杯(液基夹层杯由湖南天骑生物科技有限公司生产)中，再加入适量的液基专用消化液(不能超过20 ml)，将夹层杯置于干片机中60 ℃灭活10 min，再将其置于离心机中，以离心半径20 cm，4500 r/min离心5 min，脱盖轻缓弃去所有上清液，置干片机中60 ℃干片8 min，滴加染液A完全覆盖住基膜，置于干片机中60 ℃热染5 min，弃掉A液，用水缓慢沿杯壁冲洗2遍，滴加B液5～10滴，脱色90 s，用水缓慢冲洗2遍，脱色2次直至残余的A液脱完，滴加C液5～10滴复染1～5 min，弃去C液，缓水冲洗2次，用取片针将夹层杯内底膜顶出，用镊子夹出基片，靠近杯底的一面朝上，用吸水纸吸干表面水分。滴一滴中性胶于玻片，菌膜朝下封片。滴加镜油，使用显微镜100倍油镜阅片。

4.阳性菌株的菌种鉴定：将运送到湖南省结核病参比实验室的阳性菌株进行涂片染色，挑取抗酸染色结果为阳性的适量菌落至装有生理盐水和玻璃珠的磨菌瓶中，振荡混匀成菌液，静置15 min 后，用无菌滴管吸取0.1 ml到对硝基苯甲酸(PNB)上，置温箱培养1个月后观察结果。若PNB培养基上有菌落生长，提示为非结核分枝杆菌；若无菌落生长，提示为结核分枝杆菌复合群。同时吸取0.1 ml滴到MPB64抗原检测板上，15 min后观察结果，检测板只有1条红色的线为阴性，即提示非结核分枝杆菌或者少量MPB64抗原阴性的结核分枝杆菌复合群；出现2条红色的线为阳性，即提示结核分枝杆菌复合群。最后，将PNB阳性、MPB64阴性，PNB阴性、MPB64阴性，PNB阳性、MPB64阳性的菌株分别提取DNA，将DNA送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序，最终确定是否为非结核分枝杆菌。

5.评价指标：对比分析3种检测方法对结核分枝杆菌复合群阳性检出率的差异；并以临床诊断为参考标准，计算各种检测方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率，以及以患者进行每项检测的实际支出费用为准，计算每种方法的检测费用。

计算公式：敏感度=真阳性例数/(真阳性例数+假阴性例数)×100%；特异度=真阴性例数/(真阴性例数+假阳性例数)×100%；阳性预测值=真阳性例数/(真阳性例数+假阳性例数)×100%；阴性预测值=真阴性例数/(真阴性例数+假阴性例数)×100%；一致率=(两种方法检测均为阳性例数+两种方法检测均为阴性例数)/检测总例数×100%。

3种方法发现病原学阳性患者的平均检测费用：每种方法的检测费用均按市场价计算，即按患者进行上述检测实际支出的费用计算。液基夹层杯涂片的市场价为120元/例；L-J固体培养的市场价为50元/例；结核分枝杆菌核酸检测(恒温扩增法)的市场价为260元/例。

三、质量控制

项目研究现场的选择严格按照随机抽样方法抽取，以最大程度地反映湖南省的情况；所有参加此项目的工作人员均进行过严格系统的项目启动培训，掌握实施方案，项目实施过程中严格按照实施方案标准进行患者纳入、表格登记、实验操作、结果判断等，并同时每天做好相关仪器设备的维护保养；实验操作过程中每批测试均做阴性、阳性质控标本的测试。

四、统计学分析

采用Excel 2007软件对数据进行整理，并通过双人核实。采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。3种方法两两之间结核分枝杆菌复合群检出率的比较采用配对四格表的卡方检验，检验水准α=0.05/3=0.017；3种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率的比较，采用计算率的95%的置信区间进行比较。

结 果

一、临床诊断结果

628例可疑肺结核患者中，临床最终诊断为肺结核患者153例(24.4%)；非肺结核患者475例(75.6%)，包括非结核分枝杆菌肺病6例。其中NTM肺病患者先经过PCR检测确定为NTM，再取患者培养阳性菌株提取DNA送至测序公司进行测序，最终诊断为NTM肺病。

二、3种方法阳性检出率和结核分枝杆菌复合群阳性检出率情况

在肺结核可疑症状者中，L-J培养法、涂片法和恒温扩增法的阳性检出率分别为14.8%(93/628)、13.9%(87/628)和12.3%(77/628)。培养共接种1256管，有32管污染(64管)，污染率为5.1%；剔除6例NTM肺病患者后，涂片法、L-J培养法和恒温扩增法的结核分枝杆菌复合群阳性检出率分别为13.5%(84/622)、14.0%(87/622)和12.2%(76/622)。采用配对设计的卡方检验(剔除6例NTM肺病患者和32例培养污染的患者)，结果显示：每两种方法结核分枝杆菌复合群阳性检出率之间差异均无统计学意义，见表1～3。以临床诊断为参考标准计算3种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、一致率及其95%置信区间，三者之间差异均无统计学意义。见表4。

表1 涂片法与L-J培养法的配对四格表

表2 L-J培养法与恒温扩增法的配对四格表

表3 涂片法与恒温扩增法的配对四格表

表4 以临床诊断为参考标准判断3种方法检测的诊断效能

表5 3种方法的平均检测费用

三、3种方法的平均检测费用

3种方法发现1例病原学阳性患者的平均检测费用从高到低依次为恒温扩增法、涂片法、L-J培养法。见表5。

讨 论

最新版的肺结核诊断指南——《WS 288—2017肺结核诊断》[2]中将结核病分子生物学检测纳入了结核病病原学检查范畴，这将对各种结核病分子生物学检测方法提出更高的要求；传统的直接涂片法简单快捷、成本低、易普及，目前仍是国内最普遍使用的结核病实验室检测手段[3]，但是其阳性检出率低，难以满足临床诊断需求，因此本研究采用涂片法、L-J培养法和恒温扩增法同时检测疑似肺结核患者的痰标本，判断3种不同检测方法阳性检出率的差异。

本研究结果显示，3种检测方法对结核分枝杆菌复合群阳性检出率的差异无统计学意义；以临床诊断结果为参考标准，3种方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值差异均无统计学意义。代小伟等[4]、宋红焕等[5]和马晓光等[6]的研究结果均显示分子生物学方法的阳性检出率高于传统涂片法，这与本研究的结果不完全一致。原因可能是：(1)不同研究的试验设计方法不完全相同，本研究采用的是配对设计的前瞻性研究，而部分研究则采用成组设计的回顾性研究，一般成组设计的回顾性研究存在较大的偏倚，在方法之间进行结果的比较时，配对设计比成组设计的数据更有说服力；(2)所选用的分子生物学方法不完全相同，目前上市的结核病分子生物学检测方法种类很多，不同试剂盒的检测靶标、引物设计、扩增方式和条件均不完全相同；(3)本研究采用的涂片法是液基夹层杯涂片技术，其虽也属于涂片技术，但不同于传统的涂片方法，其采用的是“集菌法”，通过离心过滤将液化后的所有痰液全部积聚在一张膜上，再经过抗酸染色镜下观察，其最低检出限值没有数据可查，而培养的最低检出限值大约为100菌落形成单位(CFU)/ml[7]，分子生物学检测方法的最低检出限值为10～104CFU/ml[8]，简单涂片法的最低检出限值为103～104CFU/ml[9]，从方法原理上就能推测液基夹层杯的最低检出限是高于传统涂片法的。并且平均发现1例病原学阳性患者的检测费用由低到高依次为L-J固体培养、涂片法、恒温扩增法。这提示实验室在这三类诊断技术方法之间做选择时，在首要考虑各方法阳性检出率的基础上，需综合考虑各种方法的优势和局限性：液基夹层杯涂片技术操作简单，工作人员依存性高，普及程度较高，可当天出具报告，但是只能鉴定到“是否为抗酸杆菌”的水平；L-J固体培养检测费用低，操作相对简单，且可获得活菌进行药物敏感性试验，但是结核分枝杆菌生长缓慢，耗时长，需5～8周时间，明显滞后于临床对肺结核早期诊断的期望[10]；核酸检测生物安全程度高，可当天出具报告，结果可鉴定到“是否为结核分枝杆菌复合群”的水平，但是对实验室条件要求较高并且检测费用较高。

因此，实验室在进行诊断技术的选择时，应该综合考虑当前实验室条件、试剂成本、时效性、操作依从性和结果准确性等因素，选择最适合当地的结核病诊断技术。如果在经济差的地区，尤其在基层地区，建议倾向选择使用液基夹层杯涂片和L-J固体培养；若在经济条件好、实验室条件允许的地区，可根据情况同时使用液基夹层杯涂片、L-J固体培养和结核分枝杆菌核酸检测，从而保证更快、更准确地获得检测报告。