两种禽流感病毒含量测定方法的比较

王玉玲 赖道华 黄金妹 韦姜玲 福州大北农生物技术有限公司 福州 350014

禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）是严重危害家禽和野禽的一种烈性传染病病原，有可能引起全球流感大流行，是威胁我国养禽业的最重要疫病之一。目前，疫苗免疫是降低发病率和病死率的最主要方法，在常规的禽流感疫苗生产过程中，鸡胚是禽流感病毒最为常用的一种培养基质，但用鸡胚尿囊液制备抗原过程中，禽流感病毒易引起抗原性变异；大规模生产时还存在鸡胚数量不足和潜在外源病毒污染的问题，尤其在禽流感暴发时。因此，为了克服这些局限和不足，急需利用哺乳动物细胞为基质制备的疫苗，这样的疫苗具有无外源因子污染、易于规模化生产、可以较好维持病毒抗原稳定等特点。目前，我国对于禽流感病毒的效价测定方法有鸡胚培养法和细胞培养法，本试验即针对两种方法进行比较。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF蛋购自济南斯帕法斯公司，MDCK细胞购自Invitrogen公司，3批禽流感H9N2株抗原均由福州大北农生物技术有限公司生产，DMEM购自GIBCO公司，胰酶购自Difco公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡胚培养法

1.2.1.1 样品处理 将待测样品用生理盐水按10倍倍比稀释至10-9，备用。

1.2.1.2 样品接种 将稀释好的10-5~10-9样品接种10日龄SPF鸡胚，5枚/稀释度，设对照鸡胚5枚。

1.2.1.3 鸡胚培养及观察 将接种组及对照组鸡胚置于培养箱中培养，24 h开始照蛋，观察鸡胚死亡情况，每日2次，48 h后每6 h照蛋一次，直至120 h。期间将死胚取出并记录死亡时间后置于2~8℃冰箱保存，120 h后测定血凝价。

1.2.1.4 血凝价（HA）测定 取全部接种胚，按照样品及稀释度排列，进行HA测定，血凝价≥1:16判定为阳性，计算结果。

1.2.2 细胞培养法

1.2.2.1 洗细胞板 将长满MDCK细胞的培养板中的细胞培养液弃去，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液充分洗涤3次。

1.2.2.2 加液 在细胞培养板上设样品组和对照组，样品组每孔加入 0.1 mL、pH 7.4含胰酶的DMEM培养液，对照组每孔加入0.2 mL、pH 7.4含胰酶的DMEM培养液，DMEM培养液中胰酶的质量浓度为50 μg/mL；然后将细胞培养板置于33℃环境中孵育15 min。

1.2.2.3 样品处理 将待测样品用pH 7.4含50 μg/mL胰酶的DMEM培养液进行10倍倍比稀释至 10-9，备用。

1.2.2.4 接毒 取上述稀释度10-5~10-9的样品液接种细胞，8孔/稀释度，每孔0.1 mL。

1.2.2.5 培养 将接种后的细胞培养板置于33℃、5%CO2浓度的培养箱中培养120 h。

1.2.2.6 计算病毒效价 观察细胞培养板中的细胞病变情况，使用Reed-Muench方法计算TCID50值，计算病毒效价；细胞病变的判定方法为，当细胞孔内100%细胞发生病变判定为有病毒感染，计入细胞发生CPE数。

2 结果与分析

2.1 细胞培养法不同培养时间病毒含量测定结果从表1可以看出，病毒接种细胞后72 h，基本可以得出效价结果，直至120 h没有明显改变。

2.2 不同培养方法测定病毒含量结果 从表2可以看出，鸡胚培养法和细胞培养法得出的病毒含量结果差别不是很明显，并且针对细胞培养法接种孔进行HA测定，发现与通过观察细胞病变结果基本一致。

表2 两种培养方法病毒含量测定结果

从两种测定方法对比试验结果可以看出，禽流感病毒效价测定方法中细胞培养法较鸡胚培养法具有以下优势：（1）省时。细胞培养法可在接种后72 h，基本可以得出结果，而鸡胚培养法必须再培养120 h后才能进行血凝法测定病毒效价，因此，细胞培养法较鸡胚培养法更省时。（2）省力。细胞培养法测定效价过程中只需要每天观察一次细胞病变情况即可，而鸡胚培养法在接种后48 h开始需每隔6 h进行照蛋一次，及时取出死胚留待测定血凝情况，因此，细胞培养法较鸡胚培养法更省人力。（3）更稳定。利用鸡胚培养后测定血凝效价，计算EID50，该方法因使用鸡胚而受到一定的限制，如夏季高温长途运输会对鸡胚质量造成一定的影响，鸡胚中可能存在外源性病原污染等，这些都会导致效价测定结果不稳定或不准确，而细胞培养法因使用的是细胞，稳定性、均一性都较鸡胚更佳，所以，效价测定的结果也会更稳定。（4）更准确。从比较试验结果可以看出，观察CPE计算的TCID50与进行血凝测定计算的EID50相比，无明显差异，并且操作上更为简便，更重要的是，该方法避免了不同实验员因操作熟练度及血凝情况判定所造成的人为误差。

因此，细胞培养法与鸡胚培养法比较，在禽流感病毒的效价测定方面具有更准确、更稳定、更高效的优势。