基于超高效液相色谱-串联质谱技术测定饲料中喹乙醇方法探究

袁艳茹

（安阳市畜产品质量安全监测检验中心 455000）

喹乙醇又名喹酰胺醇、倍育诺、快育灵、奥拉多司等，属于人工合成的喹喔啉二氧化物类药物。 它对革兰阴性菌如巴氏杆菌、大肠杆菌、单胞菌等作用较强，对革兰阳性菌如金黄色葡萄球菌、链球菌、密螺旋体等也有一定的作用。 另外，它对其他抗生素如氯霉素、四环素等有耐药性的细菌作用敏感。 喹乙醇被作为促生长剂，因其具有促进蛋白同化，提高饲料转化率，不但能使猪增重加快，还能提高瘦肉率[1]。 因喹乙醇的广谱抗菌效果，促进生长，提高瘦肉率，曾经被广泛用于养殖业中。 但大量研究表明喹乙醇有很多毒害作用：随着喹乙醇剂量增加，可对动物的肝脏肾脏造成严重器质性损害[2]；也可对动物的免疫器官造成损害及对红细胞免疫功能产生抑制[3]；还可诱导动物生精细胞的凋亡[4]；近年来， 饲料生产过程非法添加和养殖过程中违规使用喹乙醇现象时有发生，有关喹乙醇使动物中毒报道时有出现，这就需要加强畜产品质量安全监管，从源头控制滥用及违法使用喹乙醇。由于喹乙醇多方面的危害， 国家农业农村部在2018 年发布了2638 号公告停止喹乙醇使用于食品动物。虽然发布了禁用公告，而对养殖过程中饲料中喹乙醇监测不能停， 从而杜绝非法使用喹乙醇行为。 目前饲料中喹乙醇测定方法主要有酶联免疫吸附法[5]、高效液相色谱法[6]及液相色谱-串联质谱法[7]。 酶联免疫吸附法具有前处理简单、 检测速度快特点， 但易出现假阳性或假阴性；高效液相色谱法灵敏度较低、检出限高，背景高，判定检出限附近低含量样品较为困难； 液相色谱-串联质谱法具有高灵敏度、高选择性、低检出限，定性可靠、定量准确特点。 本文超高效液相色谱-串联质谱技术测定饲料中喹乙醇也具有上面液质法特点，此外具有更高分离度，更快分析速度。 本文就是基于这种技术对饲料中喹乙醇检测原理，前处理过程、分析测定过程及结果计算就行了探究。

1 原理的探究

1.1 喹乙醇的性质

一般物质结构决定物质性质。 喹乙醇有一个醇羟基，一个酰胺基，一个喹喔啉二氧化物结构，三种结构都是极性基团，易与水形成氢键，可在水中溶解。

通过分析喹乙醇结构我们来总结喹乙醇性质：淡黄色结晶粉末，无臭苦味。 它溶于热水，微溶于冷水，几乎不溶于甲醇、乙醇、氯仿等一般有机溶剂。 熔点209℃左右（分解），常温下性质稳定，易于保存，在40℃可保存3 年。 它对光敏感，光照分解为棕色或深棕色物质[8]。

1.2 固相萃取

固相萃取（Solid Phase Extraction）简称SPE，是基于液固色谱理论，采取选择性吸附、选择性洗脱，从而对样品中目标组分进行分离、净化、富集的一个过程。 HLB SPE 柱为本文方法采用的样品分离、净化和富集SPE 柱，这种SPE 柱不存在传统反相硅胶键合柱存在的问题。 这种SPE 柱为亲水亲脂平衡共聚物SPE柱，它既有亲水基团，使填料具有水可浸润性，又有亲脂基团，使填料具有反相保留能力。 HLB SPE 柱比传统反相SPE 柱有以下优势：平衡上样时即使干涸对回收率和重复性无影响；pH 应用范围广为1～14；吸附剂亲水结构（极性结构）有助于保留亲水性物质；填料无硅醇基结构，不会吸附碱性物质，比表面积也很大，用料比传统硅胶吸附剂少很多。

HLB SPE 柱可以去除样品中基质干扰、分离富集目标组分、增强仪器性能、增强分析信号、降低噪音、简化工作流程，特别对于液相色谱质谱这种高灵敏度仪器， 减少基质干扰和富集组分至关重要。

1.3 超高效液相色谱-串联质谱技术测定饲料中喹乙醇原理

采用甲酸乙腈溶液在40℃超声提取饲料中喹乙醇，经HLB SPE 柱分离净化后，经60℃氮吹浓缩，在用乙腈溶液溶解，之后上超高效液相色谱-串联质谱分析测定，基质匹配标准品，外标法定量。

甲酸乙腈溶液为极性有机水溶液既可沉淀蛋白又可以提取极性有机物喹乙醇， 而喹乙醇在热水中溶解， 所以40℃超声提取。 喹乙醇结构中既有亲水基团（极性基团）又有亲脂基团（非极性基团），用亲水亲脂聚合物HLB SPE 柱净分离化正好。 喹乙醇受基质影响较大，所以用基质匹配标准品，上超高效液相色谱-串联质谱分析测定，既可以准确定性，又可以外标法准确定量。

2 前处理过程探究

因喹乙醇对光敏感，整个前处理过程注意避光。

2.1 样品提取过程探究

准确称取饲料样品，相同质量基质匹配空白试样，相同质量基质匹配空白试样（作阳性添加用），分别于50mL 聚丙烯离心管中，同时准备一个空管作试剂空白。 空白样品里加入一定量标准储备液这就是阳性添加样品。 加入10mL 0.1%甲酸乙腈溶液，高速涡动混匀1min，使提取液充分浸润饲料，为充分提取做准备。40℃超声提取10min，因喹乙醇在热水中溶解，再加上超声振动，使提取更加充分。 9000r/min 离心15min，经过离心，管中液固分离，目标组分转移到液体中，收集上清液即可。 残渣用上面同体积提取液重复提取一次，合并两次提取液，混匀，为总提取液。 提取一次能提取到目标组分80%左右， 重复提取一次可达到完全提取。

准确移取5mL 总提取液于试管中，60℃氮吹至2mL， 氮吹可以充分挥发掉样液中乙腈， 样液中60%乙腈不利于样品净化时目标组分的保留。 之后加入4mL 0.1mol/L 磷酸二氢钾溶液，目的是调节样液pH 为下一步HLB SPE 柱净化做准备， 涡动使残余物充分溶解，为备用液。

2.2 样品净化过程探究

按照样品数量取HLB SPE 柱，一次用3mL 甲醇活化，甲醇充分浸润吸附剂，进入吸附剂孔内并保留在吸附剂内。 再用3mL水平衡， 为上含水样品做准备。 取所有样品备用液分别过HLB SPE 柱， 目标组分直接与吸附剂发生亲水亲脂作用而保留在吸附剂上。之后用0.02mol/L3mL 盐酸淋洗，主要洗掉一些水溶性碱性杂质，之后用3mL 5%甲醇淋洗，主要洗掉一些极性有机杂质，淋洗完后挤干。 然后用5mL 纯甲醇洗脱，收集洗脱液，主要将保留在吸附剂上目标组分喹乙醇用纯极性有机溶剂甲醇洗脱下来。 60℃氮吹至干，将溶剂甲醇挥发掉，只剩下目标组分在试管中，这是浓缩目标组分。 最后加入20%乙腈溶液高速涡旋充分溶解，为净化液。 过0.22μm 滤膜，待上机测定。

2.3 基质匹配标准溶液制备过程探究

取合适浓度的乙腈喹乙醇适量，氮气吹干，用1mL 基质匹配空白样品的净化液溶解，配制成浓度为5、10、20、50、100ng/mL基质匹配标准溶液，过滤膜上机即可。 对于超出校准曲线浓度范围样品，样品净化液用20%乙腈稀释多少倍，一般基质匹配标准溶液和阳性添加样品净化液也稀释多少倍， 这样用基质匹配标准品外标校准样品，重复性和回收率比较好。 由于超高效液相色谱-串联质谱的仪器灵敏度很高，校准曲线最高浓度点不宜超过100ng/mL。

3 分析测定过程的探究

3.1 色谱条件探究

色谱柱：BEH C18 柱，柱长5cm，内径2.1mm，粒径1.7μm，超高效液相色谱柱体现内径小（普通色谱柱4.6mm）、粒径小（普通色谱柱5μm）这样分离度高，灵敏度高、分析速度快。

流动相：A 为乙腈，B 为0.1%甲酸水溶液，模式为梯度洗脱程序，梯度洗脱程序为：起始状态A 为6%、B 为94%；2.5 分钟时候A 为15%、B 为85%；3.0 分钟时候A 为100%、B 为0%；4.0 分钟时候A 为100%、B 为0%；5 分钟时候A 为6%、B 为94%。0.1%甲酸溶液有利于目标组分离子化。

流速：0.3mL/min；进样量：2μL。

3.2 质谱条件探究

电喷雾离子源；正离子扫描；多反应监测MRM；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：150℃；脱溶剂温度：500℃；脱溶剂气流速：1000L/h； 锥孔气流速：150L/h； 碰撞气流速：0.15mL/min；定性、 定量离子对和锥孔电压、 碰撞能量为264.16>143.10、36V、34eV；264.16>212.08、36V、24eV。

3.3 定性定量测定探究

3.3.1 定性测定探究

一种药物一般选择1 个母离子和2 个母离子的碎片特征子离子，相同实验条件下，色谱图中待测物选定三个离子保留时间与这种药物标准溶液中对应三个离子保留时间偏差在±2.5%之内， 而且待测物定性离子离子丰度比与浓度接近这种药物标准溶液定性离子离子丰度比比较，定性确证偏差按下面规定来，离子丰度比用k 表示，允许偏差用d 表示。当k>50%，d 为±20%；当50%≥k>20%，d 为±25%； 当20%≥k>10%，d 为±30%； 当k≤10%，d 为±50%。为当则可判定样品中存在这种待测药物[7]。试剂空白和样品空白色谱图中不能出现和阳性添加样品相同定性定量离子对。 目标药物定性确证选择三个离子和定性离子离子丰度比范围都是参照欧盟2002/657/EC 指令（结果分析与方法性能要求），对LC/MS/MS 来说，质谱法确证有机化合物或污染物需要4 个IP 点对应是1 个母离子和2 个母离子的碎片子离子。 定性离子离子丰度比一般指色谱图中定性离子峰面积与定量离子峰面积之比。

3.3.2 定量测定探究

一般是在仪器最佳条件下，对基质匹配标准溶液、待测阳性添加样品溶液，待测样品溶液进样，上机测定。 之后用基质匹配标准溶液峰面积和浓度去分别校准待测阳性添加样品溶液和待测样品溶液峰面积， 即可分别得出待测阳性添加样品溶液和待测样品溶液的浓度。 外标法单点或多点校准即可。

4 结果计算的探究

对于计算出阳性结果， 核查待测样品定性离子的离子丰度比是否在定性确证规定的范围内，用来确证是否为这种药物；质控阳性添加样品回收率也要在一定范围内， 主要用于反映分析人员的操作技术水平， 更重要的是它反应了分析方法是否适合被测物质，帮助分析人员及时地发现分析中存在的问题，确保分析数据准确、可靠；两次独立测定结果相对偏差不超过20%，考察测定结果精密度，精密度越好、准确度才能越好。

5 结语

本文对用超高效液相色谱-串联质谱技术测定饲料中喹乙醇进行了原理， 前处理过程、 分析测定过程及结果计算进行探究，通过对用这种方法测定饲料中喹乙醇研究，我们对这种方法检测喹乙醇更加清晰明了。 对于从事这方面检测工作者提供了一个参考。 这种方法更高选择性、更高灵敏度、更低检出限、更快分析速度、更高分离度、更准确定性定量方法，必将成为以后喹乙醇检测趋势， 也为饲料中喹乙醇准确快速定性定量提供了便利。