微RNA在皮肤鳞状细胞癌中的作用研究进展

李智，吕建建

(青岛市市立医院皮肤科，山东 青岛 266000)

皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma，CSCC)是常见的皮肤恶性肿瘤之一，是一种源于表皮角质形成细胞的肿瘤。随着我国人口老龄化的加剧，其发病率逐年升高[1-2]。CSCC主要表现为面、颈、手背等曝光部位皮肤表面红斑或丘疹性病变，常有鳞状鳞屑或结痂现象，大部分CSCC经手术切除可得到彻底治疗，但低分化以及肿瘤直径>2 cm、深度>2 mm的CSCC易复发和转移[3]。既往研究显示，紫外线照射、化学致癌物、人乳头瘤病毒感染以及基础皮肤病等是CSCC的危险因素[4]，但具体发病机制较为复杂。陆晓鸥等[5]基于GEO(Gene Expression Omnibus)数据库进行CSCC基因表达及信号转导通路的生物信息学分析研究显示，基因芯片数据中共有894个差异基因，包括438个上调基因和456个下调基因。基因本体论分析显示，上调基因主要富集的生物进程包括有丝分裂细胞周期过程、染色体分离、有丝分裂核分裂，下调基因主要包括表皮发育、角质形成细胞分化、表皮细胞分化；而京都基因和基因组百科全书路径分析显示，上调基因主要富集的信号转导通路为DNA复制、细胞周期、错配修复，下调基因为促分裂原活化的蛋白激酶信号通路、Notch信号通路和背腹轴的形成[5]。进一步研究显示，微RNA(microRNA，miRNA)的异常表达也与CSCC的临床表现及病理学特征相关，在细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用[6-8]。现通过回顾既往关于CSCC miRNA表达谱和miRNA作用机制的研究，探索miRNA在CSCC增殖、迁移及侵袭过程中的作用。

1 miRNA概述

1993年，Lee等[9]在秀丽新小杆线虫中发现了第1个miRNA——lin-4，lin-4通过与靶基因RNA 3′非编码区结合负调控lin-14信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达，导致lin-14蛋白水平下降；同时发现，lin-4突变导致功能丧失与基因突变获得功能的编码蛋白基因lin-14引起的效应一致，均能导致蠕虫发育时序混乱，因此推测lin-4是一种能阶段性调控胚胎发育的基因[10]。随后发现了大量由19～23个核苷酸组成的类似内源性非编码单链RNA，统称为miRNA[11]。miRNA的体内合成是一个多步骤过程。在细胞核内，RNA聚合酶Ⅱ将miRNA编码基因转录为具有茎环结构的miRNA初始转录产物，然后miRNA初始转录产物被RNase Ⅲ内切酶Drosha和双链RNA特异性结合蛋白迪乔治综合征危象区基因8加工为具有发卡结构的前体miRNA；接下来，输出蛋白5将前体miRNA转运出细胞核后被细胞质中的RNaseⅢ内切酶Dicer剪接成双链miRNA(即miRNA*复合体)；双链分离后，miRNA*被降解或参与调节miRNA的稳定性，而另一条单链作为成熟的miRNA形成RNA诱导沉默复合物[11]。RNA诱导沉默复合物与靶基因mRNA进行完全或不完全互补配对，导致mRNA降解(完全配对)或翻译抑制(不完全配对)，以实现转录后水平的基因表达调控[11]。

迄今为止，人体内已发现1 000多种miRNA，占人类基因组的1%，每个miRNA均可能有数百个靶点，调控人体内超过30%基因的表达，在早期发育、细胞增殖、分化和凋亡以及造血等正常生理过程中发挥调控作用[11-13]。此外，miRNA的表达异常可能与肿瘤的发生和发展相关[14]，可作为诊断、治疗以及评价肿瘤预后等方面的生物学标志物[15]。

2 miRNA在CSCC中的表达情况

为探索miRNA在CSCC发病机制中的作用，众多研究对CSCC癌组织中miRNA的表达情况与癌旁组织、健康皮肤组织、皮肤病组织进行比较发现，miR-21、miR-31[16]、miR-99a/100、miR-205、miR-221[17]、miR-365等在癌组织中的表达上调，而miR-20a[18]、miR-34a、miR-124、miR-124/214、miR-125b[19]、miR-155、miR-148[20]、miR-193b/365a、miR-199a、miR-203、miR-361-5p、miR-375、miR-483-3p、miR-497[21]、miR-3619-5p[22]等在癌旁正常组织中表达上调[23]。以上表达谱提示，miRNA在CSCC的发生、发展过程中可能发挥重要作用，而且可能通过调节癌基因和抑癌基因的表达发挥双重作用，一方面可以促进癌变，另一方面也可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移[24]。

3 miRNA在CSCC增殖、迁移和侵袭中的双重调控作用

癌细胞的大量增殖是癌症发生的初始阶段，而大量增殖的癌细胞需要占用大量的营养供给，从而影响正常组织的能量供给。同时，癌细胞还会代替相关部位的正常细胞，导致正常细胞功能缺失。此外，增殖的癌细胞形成肿块会压迫周围器官和组织，造成周围脏器缺血缺氧。细胞迁移和侵袭是肿瘤癌变转移的最关键步骤，细胞在接收到内源和外源性迁移信号后通过胞体形变进行定向移动，肿瘤细胞经血管基膜穿入深面间质后侵袭组织和转移至远处。因此，miRNA可能在CSCC的增殖、迁移和侵袭过程中发挥双重调控作用。

3.1促进CSCC的miRNA miR-31是CSCC表达谱中上调最明显的miRNA之一，具有多个靶基因，参与细胞周期、DNA修复、代谢、细胞凋亡、趋化因子信号通路和化学抵抗性[25]。Wang等[16]将CSCC与光化性角化病皮肤、健康皮肤进行比较发现，CSCC中miR-31过表达；在CSCC细胞系(UT-SCC-7细胞)中，抑制miR-31表达会显著降低UT-SCC-7细胞的转移和集落形成能力，提示miR-31在CSCC进展过程中主要通过促进癌细胞迁移和侵袭发挥作用。Lin等[26]发现，Rho相关结构域BTB蛋白质1也是miR-31的直接靶基因，而Rho相关结构域BTB蛋白质1是小GTPase的Rho家族成员，是一种肿瘤抑制因子。通过干扰小RNA沉默或敲低A-431细胞系发现，miR-31可通过抑制Rho相关结构域BTB蛋白质1的表达诱导细胞增殖和侵袭。以上研究均提示了miR-31在CSCC调控中的重要作用。

miR-205在肿瘤中的表达上调，并与结缔组织增生、神经周围浸润和浸润性生长方式等相关[27]。Caueto等[28]在成熟鼠类CSCC细胞系中发现，miR-205主要在肿瘤的未分化区域和侵袭前沿表达，提示miR-205可能与局部复发和进化缓慢的临床事件的发展有关。Stojadinovic等[29]也观察到侵袭性CSCC中miR-205的表达较原位CSCC显著增加，且侵袭性CSCC中miR-205的靶基因(如髓性热带病毒整合位点1同源物、赖氨酸乙酰基转移酶2B和博来霉素水解酶重组蛋白)水平明显下调。表明miR-205及其靶基因可作为CSCC的预后标志物。

miR-221在肿瘤的起始和进展中发挥关键作用，包括调控增殖信号通路，避免肿瘤因子导致的细胞死亡，监测血管生成，甚至支持上皮-间充质转化[30]。Gong等[17]发现，CSCC癌组织中miR-221的表达上调，对miR-221进行模拟物或抑制剂转染发现，miR-221的上调显著促进了细胞增殖，而下调的miR-221则抑制了癌细胞的增殖；荧光素酶活性测定技术发现，miR-221直接靶向人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN)，CSCC组织中miR-221和PTEN信使RNA的表达呈负相关，miR-221下调可通过靶向结合PTEN抑制细胞增殖。PTEN蛋白是最经典的肿瘤抑制因子，通过磷酸酰胺肌醇的去磷酸化，导致驱动肿瘤发生的磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号过度激活。通过敲低miR-221可引起磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径表达减少，PTEN蛋白表达增加，从而导致肿瘤发生[17]，为肿瘤治疗提供了新途径。

miR-365在CSCC患者中的表达上调，可能具有促进CSCC发生发展的作用。Zhou等[31]证实，Bcl-2相关X蛋白是miR-365的直接靶点，CSCC中miR-365上调引起Bcl-2相关X蛋白消耗，进而促进肿瘤生长，增强肿瘤的增殖、迁移、侵袭以及对细胞凋亡的抵抗力。同时，miR-365还可靶向核因子I/B对细胞周期蛋白依赖性激酶6和细胞周期蛋白依赖性激酶4的转录抑制作用，进而抑制CSCC进展[32]。此外，使用miR-365拮抗剂抑制miR-365可抑制体内皮肤肿瘤形成，促使G1期阻滞和癌细胞凋亡[33]。因此，miR-365可能是CSCC治疗的新靶点。

miR-506对许多生物反应的发生起至关重要的调节作用，不仅影响细胞增殖，还对细胞分化、迁移和侵袭有显著的调控作用。miR-506在许多不同类型的癌症中发挥作用，如在肝癌中抑制细胞增殖和肿瘤生长[34]，在宫颈癌中抑制癌细胞增殖[35]，在胃癌中抑制癌细胞的迁移侵袭和血管生成[36]。但有关miR-506参与CSCC的报道较少。Zhou等[37]发现，miR-506的表达在CSCC组织和细胞中显著上调，而下调miR-506则导致肿瘤发生受抑制；进一步研究发现，转染miR-506抑制剂的CSCC系细胞增殖速率降低，且p65和层粘连蛋白γ1的水平显著升高。p65(核因子κB)信号通路启动抗凋亡，而凋亡是抑制肿瘤异常生长的重要保护途径，因此miR-506的异常表达可能干扰了核因子κB信号通路的凋亡过程。层粘连蛋白γ1属于层粘连蛋白家族的癌基因，调控着细胞的转移、信号转导、分化和黏附，其过表达与肿瘤细胞的侵袭、迁移特性增强以及不良预后相关[38-39]。

3.2抑制CSCC的miRNA miR-15b作为miR-15家族的重要成员，虽然并未发现其在CSCC中异常表达，但miR-15b的抑癌作用可能成为CSCC的潜在治疗靶标。Zhang等[40]研究发现，miR-15b转染会显著降低SCL-1细胞的活力、诱导细胞凋亡并减少细胞中生存蛋白信使RNA的表达。生存蛋白是凋亡相关蛋白的重要成员之一，具有促进癌细胞浸润和转移的作用，而miR-15b转染会导致生存蛋白表达下调，从而抑制癌细胞转移。

miR-20a在不同肿瘤中的作用不一致，在结直肠癌、涎腺腺样囊性癌、胆囊癌、胃癌、肺泡横纹肌肉瘤等肿瘤中miR-20a的表达明显增加，而在乳腺癌、CSCC、肝细胞癌、口腔鳞状细胞癌和上皮性卵巢癌中，miR-20a的表达显著减少[41]。Zhou等[18]对miR-20a在CSCC中的作用进行研究发现，miR-20a直接作用于LIM激酶1，使CSCC细胞生长速度减缓并抑制迁移。LIM激酶1参与许多涉及细胞骨架的生物学过程，如神经突起生长、胚胎生长、血栓形成、记忆形成等，可能是乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤转移的促进剂[18]。但也有研究持不同意见，认为miR-20a的低表达与不良预后有关。Zhang等[42]研究发现，miR-20a低表达患者的总体生存率明显低于miR-20a高表达者。因此，miR-20a的确切作用仍需进一步验证。

miR-124和miR-214与多种肿瘤相关，其中miR-124主要与胃肠道肿瘤相关[43]，而miR-214[44]主要与皮肤癌相关，其作用机制可能与胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)水平有关，ERK1的表达水平受miR-214影响，ERK2则受miR-124和miR-214的影响。研究显示，Ⅱ/Ⅲ期CSCC患者miR-124和miR-214的表达下调，而CSCC细胞系中ERK1/2蛋白水平升高[45]。因此，miR-124/214及其靶基因ERK1/2的水平很可能是CSCC发生发展的原因之一。

在肿瘤中有很多已知的靶基因，包括Bcl-2、基质金属蛋白酶13、细胞周期蛋白依赖性激酶、人胰岛素样生长因子1受体以及表皮生长因子受体2/3[5]。Xu等[19]发现，miR-125b在CSCC组织中下调，且miR-125b与基质金属蛋白酶13的表达水平呈负相关，提示基质金属蛋白酶13可能是miR-125b在CSCC中发挥作用的直接靶点。此外，miR-125b还可能通过靶向信号转导及转录激活因子3通路在CSCC中起肿瘤抑制作用[45]。进一步研究发现，PICSAR基因敲除通过上调miR-125b和下调Yes相关蛋白1抑制CSCC肿瘤生长[46]。

miR-148a可通过调整细胞周期发挥抑制细胞增长的作用，同时还可抑制CSCC细胞的迁移和侵袭。Luo等[20]发现，miR-148a通过下调促分裂原活化的蛋白激酶激酶4和9两个靶基因的表达，抑制CSCC细胞系(A431和SCL-1)细胞增殖，并降低两种细胞的集落形成率；蛋白质印迹法显示，miR-148a抑制了SCL-1细胞的迁移和侵袭，从而对肿瘤的发生和发展起抑制作用。

miR-193b是表皮细胞中表达较丰富的miRNA，在肿瘤发生中起抑制作用。既往研究显示，miR-193b可抑制黑色素瘤、乳腺癌等多个肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和存活[47-48]。Gastaldi等[49]在小鼠表皮鳞状细胞癌中发现，miR-193b的异位表达有抑癌作用，且KRAS和MAX是miR-193b的直接靶目标。

miR-199a前体产生成熟的miR-199a-5p和miR-199a-3p，它们与肿瘤的发生发展、心肌细胞保护以及骨骼形成有关，其中miR-199a-5p在CSCC中低表达，其抑癌机制可能与靶向有丝分裂分子有关[50]。Kim等[51]的研究发现，miR-199a-5p的过表达抑制了皮肤角质形成细胞的迁移能力，其可能通过调节基底细胞附着分子、卷曲同源物6和盘状结构域受体酪氨酸激酶1靶基因的表达抑制癌细胞的侵袭，发挥抑癌作用。Lu等[52]还发现，miR-199a-5p通过沉默信息调节因子1/CD44胞内结构域信号通路影响细胞的迁移能力和致瘤性，从而调节CSCC的进展。这几种靶基因的发现解释了miR-199a-5p在CSCC发病机制中的作用，也为CSCC的治疗提供了依据。

原发性CSCC中，miR-203的表达可能与良好预后相关，其主要存在于分化良好的区域[28]。Ting等[53]的研究表明，miR-203过表达可抑制CSCC细胞系(SCL-1)细胞的增殖、侵袭和迁移，同时加速细胞凋亡，这主要与胞质分裂调控蛋白1和Wnt/β联蛋白信号通路有关。Lohcharoenkal等[54]发现，c-MYC基因是miR-203的一个直接靶点，而c-MYC可促进细胞增殖，与多种肿瘤的发生发展有关。在CSCC中，c-MYC的过表达逆转了miR-203诱导的生长停滞，提示恢复miR-203表达可抑制c-MYC导致的过度增殖，并为miR-203在CSCC中作为预后指标提供依据。

癌组织的生长需要形成大量血管以汲取营养物质，而血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)是大部分肿瘤中最主要的血管生成因子，其高表达可能与肿瘤血管生成增加相关[55]。Kanitz等[56]研究发现，VEGFA与miR-361-5p的表达水平呈负相关，CSCC样本中miR-361-5p的水平显著低于健康皮肤样本。miR-361-5p可通过调控皮肤上皮细胞与内皮细胞之间VEGFA的稳定表达发挥抑制血管生成的作用，从而抑制肿瘤的发生和发展。VEGFA是miR-361-5p的第1个靶基因，这为靶基因治疗CSCC在临床中的应用提供了重要线索。

miR-497通过调整细胞周期发挥抑制细胞增长的作用。Wei等[21]研究发现，CSCC组织和细胞系中miR-497的表达水平明显低于正常组织细胞；miR-497过表达使CSCC细胞系细胞(A431和HSC-5)G0/G1期时间显著延长，而S期显著缩短，表现为细胞周期停滞；双重荧光素酶报告基因鉴定发现，FAN114A2很可能就是miR-497的直接靶基因[21]。但Mizrahi等[7]发现，miR-497的表达在角质形成细胞恶化进程中呈进行性增加，能够诱导上皮细胞向间质细胞转变，且荧光素实验证明纤溶酶原激活因子抑制因子型1是miR-497的靶点。因此，miR-497在CSCC中的作用仍需更多研究证明。

miR-3619-5p在人类恶性肿瘤中具有抑制肿瘤的作用，但其在CSCC进程中的生物学功能仍不清楚。Zhang等[22]的研究发现，与正常细胞相比，对顺铂耐药CSCC细胞中miR-3619-5p的表达明显下调。使用miR-3619-5抑制剂敲除CSCC细胞系(A431和HSC-5)中miR-3619-5p的表达促进了亲代癌细胞的增殖，这主要是通过调节和转运蛋白亚基4引发了CSCC的抑癌活性以及对顺铂的耐药性[57]。

4 小 结

CSCC是继黑色素细胞癌之后最常见的皮肤癌症之一，确诊率不断升高。miRNA作为人体基因表达调控的重要工具，越来越受到医学研究者的重视，其表达可对与疾病相关的多种细胞过程产生影响，特别是在致癌和抑癌过程中的作用。目前关于miRNA与CSCC的相关研究较少，其作为生物标志物用于诊断、治疗靶点以及预测预后还存在很多问题，但不可否认miRNA为探索肿瘤发生机制提供了新的突破点。未来需要继续深入研究与CSCC相关的miRNA及靶基因，通过改变miRNA的水平以及靶基因调控CSCC细胞的增殖、迁移和侵袭，从而预防和治疗CSCC，进而改善患者的生活质量。