线粒体自噬中受体蛋白FUNDC1研究进展

罗以楠综述，邱俏檬，卢中秋，姚咏明审校

0 引 言

现已明确，线粒体在细胞中执行与疾患病理生理相关的重要功能：①产生三磷酸腺苷为细胞提供能量；②缓冲钙离子，维持钙稳态；③产生并调节活性氧(reactive oxygen species，ROS)；④通过线粒体膜通透性转换孔调控细胞凋亡[1-2]。

线粒体自噬是通过自噬机制选择性清除功能障碍线粒体或非必需线粒体的过程，在维持细胞稳态过程中具有重要意义[3-4]。当线粒体受损时，线粒体及自噬相关基因(autophagy-related gene，ATG)上游蛋白在自噬小体形成位点处聚集。Parkin泛素化受损的线粒体。泛素化的线粒体及ATG上游蛋白与自噬小体形成位点发生联系，通过微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)与自噬小体结合并被降解[5]。研究证实线粒体自噬通过两条途径进行调节，包括Pink1-Parkin介导的线粒体自噬和受体介导的线粒体自噬[6]。其中PTEN诱导激酶蛋白1(PTEN-induced putative kinase protein 1，Pink1)和Parkin介导线粒体膜电位下降诱导线粒体自噬[7]；目前发现的线粒体自噬相关受体包括NIX、BNIP3和含FUN14域蛋白1(FUN14 domain containing 1，FUNDC1)，其单独或相互作用在线粒体自噬激活过程中发挥重要作用[8-9]。FUNDC1作为哺乳动物细胞内新型线粒体受体蛋白，已被证实在低氧条件下能够介导线粒体自噬[10]。本文主要就FUNDC1介导线粒体自噬的调节机制及其在相关疾病中的作用作一综述。

1 FUNDC1与线粒体自噬

1.1 FUNDC1的结构与功能 FUNDC1是哺乳动物细胞中介导线粒体自噬的新型线粒体膜蛋白[11]，由155个氨基酸构成[10]。FUNDC1位于线粒体上，包含3个跨膜结构域，以及暴露于细胞质的N端结构域与插入线粒体外膜的C端结构域[12]。其中暴露于细胞质的N端含有一段典型的LC3相互作用区(LC3-interacting region，LIR)：Y(18)xxL(21)序列[10]。通过改变或敲除LIR结构域使其失活，可抑制自噬体膜的形成，FUNDC1与LC3相互作用减少，线粒体自噬减弱。敲除内源性FUNDC1可显著抑制低氧诱导的线粒体自噬，此现象可通过在野生型FUNDC1的表达而逆转，但在LIR缺陷的FUNDC1突变体中不可逆转。这表明FUNDC1通过LIR与LC3相互作用以选择性介导线粒体自噬。研究提示，肉瘤基因(Sarcoma gene，Src)激酶失活与FUNDC1去磷酸化及低氧条件下线粒体自噬的发生密切相关。进一步通过质谱分析显示，LIR序列中Tyr18为一个潜在的磷酸化位点，且在低氧状况下其磷酸化水平降低。在正常生理条件下，活化的Src激酶磷酸化Tyr18抑制FUNDC1介导的线粒体自噬；而在低氧条件下，Src失活引起FUNDC1去磷酸化，导致FUNDC1与LC3-Ⅱ相互作用增强而激活线粒体自噬。Lv等[13]提出，FUNDC1上磷酸化Tyr18和Ser13分别阻碍FUNDC1与LC3-Ⅱ的疏水端和Arg10的相互作用，而LC3-Ⅱ的侧链Lys49转移并与FUNDC1磷酸化Ser17形成氢键和静电作用，进而介导线粒体自噬的发生。

1.2 FUNDC1介导线粒体自噬 在生理条件下，FUNDC1以磷酸化形式稳定存在于线粒体膜而不诱导线粒体自噬的发生。但在低氧或线粒体解偶联时，unc-51样激酶1(unc-51 like kinase 1，ULK1)磷酸化FUNDC1上Ser17，磷酸甘油变位酶家族蛋白5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)使Ser13去磷酸化，促进FUNDC1与LC3相互作用及线粒体自噬的发生[14]。Wu等[15]通过FUNDC1的ULK1结合缺陷型突变体及FUNDC1敲除实验，证实其失活破坏ULK1向受损线粒体移位并抑制线粒体自噬，提出FUNDC1是ULK1的线粒体定位底物，可能具有ULK1适配器效应。Ser17和Tyr18为两个相邻的位点，ULK1磷酸化FUNDC1上Ser17促进线粒体自噬，而Src激酶磷酸化LIR基序中Tyr18抑制FUNDC1介导的线粒体自噬。进一步研究发现，Src激酶抑制ULK1与线粒体结合进而下调ULK1在Ser17上FUNDC1磷酸化。由此可见，ULK1和FUNDC1是线粒体自噬所必需的，且通过协同效应共同调节线粒体自噬。

此外，PGAM5使Ser13去磷酸化，从而促进FUNDC1与LC3相互作用及线粒体自噬[16]。由于FUNDC1的Ser13去磷酸化是可逆的，肌酸激酶2(creatine kinase 2，CK2)能通过磷酸化Ser13抑制PGAM5-FUNDC1介导的线粒体自噬。在低氧或者线粒体氧化磷酸化解偶联剂FCCP处理时，采用敲除或抑制剂分别使CK2或Src激酶失活并不足以激活线粒体自噬，而同时抑制两者则显著激活线粒体自噬。表明CK2与Src激酶具有丰富的成组活性，以确保在非应激条件下抑制线粒体自噬[14]，且Ser13与Tyr18的磷酸化在功能上协同调节FUNDC1介导的线粒体自噬[16]。早先的研究已经表明，线粒体膜电位下降引起Pink1积累，使Parkin募集到受损线粒体上以激活线粒体自噬[7]。有学者提出受体途径亦参与线粒体膜电位下降诱导的线粒体自噬[16]。在线粒体自噬中，PGAM5-FUNDC1可能与Pink1-Parkin途径间有协同作用。有资料观察到PINK1与PGAM5相互作用，且PGAM5缺失抑制由Pink1介导的线粒体自噬[17]。而敲除FUNDC1可减少Parkin移位至线粒体[16]。Wu等[18]发现BCL2L1/Bcl-xl通过其BH3结构域抑制FUNDC1介导的线粒体自噬。在含氧量正常条件下，BCL2L1与PGAM5相互作用，抑制其磷酸酶活性，阻碍FUNDC1去磷酸化，进而抑制线粒体自噬的发生；而在低氧或FCCP处理时，BCL2L1降解导致PGAM5激活，催化FUNDC1在Ser13上去磷酸化，去磷酸化的FUNDC1与LC3相互作用以激活线粒体自噬。通过诱导表达和敲除实验处理BCL2L1，发现BCL2L1表达水平决定了PGAM5介导FUNDC1去磷酸化和线粒体自噬水平。而无论BCL2L1水平如何，敲除PGAM5均可抑制线粒体自噬。因此，BCL2L1-PGAM5-FUNDC1轴对在低氧条件下由受体介导的线粒体自噬十分重要。

另据报道，微小核糖核酸-137通过线粒体自噬受体FUNDC1和NIX，破坏其与LC3结合，进而抑制线粒体自噬[19]。深入探究微小核糖核酸的作用机制和线粒体自噬的调控，可为相关疾病的防治提供新思路。

1.3 FUNDC1与线粒体动力学 线粒体动力学即线粒体通过融合和裂变保持其动态平衡的过程，而线粒体融合与裂变失衡是线粒体自噬的先决条件[20]。生理条件下，线粒体通过细胞器内相关蛋白酶的融合和裂变来抑制及延缓异常改变的累积，以维持线粒体各项生理功能的正常运行，这一过程称之为线粒体的质量控制[2]。线粒体融合主要由线粒体外膜上的线粒体融合蛋白1(mitofusin1，Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin2，Mfn2)和线粒体内膜上的视神经萎缩1(optic atrophy 1，OPA1)介导，而线粒体裂变则主要由动力相关蛋白1(dynamic-related protein 1，DRP1)介导[21]。

Chen等[20]研究发现FUNDC1与OPA1或DRP1相互作用，以调节线粒体裂变、融合和自噬。其中，OPA1通过其Lys70残基与FUNDC1相互作用。当Lys70发生变异时，OPA1与FUNDC1的相互作用被抑制而促进线粒体分裂和自噬。在线粒体应激情况下，去磷酸化FUNDC1可促进FUNDC1-OPA1复合物解离，与DRP1结合并促进DRP1募集到线粒体。提示FUNDC1参与调节线粒体裂变、融合及线粒体自噬，且介导线粒体双层膜结构的耦合以调控动力和质量。另外，Wu等[11]研究发现线粒体在被自噬小体前体吞噬前需先分裂。在低氧条件下，FUNDC1聚集于线粒体膜与内质网(endoplasmic reticulum，ER)钙结合蛋白(calnexin，CANX)相互作用。CANX的N端与FUNDC1亲水区结合，由于CANX的N端位于ER内腔，所以这种结合是间接的。因此，推测FUNDC1和CANX间可能存在中间蛋白。随着线粒体自噬进行，FUNDC1从CANX解离并募集DRP1以驱动响应缺氧应激的线粒体裂变。与CANX相同，DNM1L也与FUNDC1亲水区结合。此外，在低氧细胞中敲除FUNDC1、DRP1或CANX会引起线粒体伸长，细长线粒体数量增加，自噬小体和线粒体的共定位减少，进而阻止线粒体自噬。证明FUNDC1是DRP1的一种新型受体，并可能是低氧条件下调控线粒体裂变与线粒体自噬的关键分子。新近研究发现，线粒体的E3连接酶MARCH5通过泛素化降解裂变受体，如MIEF2/MiD49和FIS1，以泛素化DRP1或减少DRP1募集，进而抑制线粒体裂变[22]。之后有学者提出MARCH5而不是Parkin可通过泛素化Lys119位点降解FUNDC1以调节低氧诱导的线粒体自噬[23]。与Parkin泛素化大量线粒体外膜蛋白介导的线粒体自噬不同，MARCH5通过特异性泛素化和降解FUNDC1而微调线粒体自噬。MARCH5-FUNDC1轴的调节可使线粒体降解脱敏从而避免未受损线粒体的错误清除。因此，该轴可能起负反馈调节作用以保护线粒体免受自噬。进一步分析发现，在低氧早期，MARCH5寡聚体分解并增强其与FUNDC1相互作用以泛素化降解FUNDC1，减少线粒体自噬过度启动，从而避免不必要的线粒体清除。而随着低氧刺激持续，FUNDC1去磷酸化随之增加，线粒体自噬大量激活[24]。

2 FUNDC1与疾病的关系及其意义

线粒体自噬具有两面性，一方面正常范围内的线粒体自噬有助于维持细胞内环境稳定，另一方面过高或过低的线粒体自噬都会引发疾病。近年来研究显示，线粒体自噬与人类多种疾病密切相关，包括心血管疾病、肿瘤、炎症及神经退行性疾病等。而FUNDC1作为介导线粒体自噬的新型受体蛋白，深入认识其在相关疾病中潜在作用，可为疾病防治开辟新途径。

2.1 FUNDC1与心血管疾病 心脏是全身血液循环动力来源，心肌作为高能量需求的组织，线粒体在维持心脏功能中发挥重要作用[25-26]。大量证据表明，线粒体动力学失调是心血管疾病致病因素之一[27-30]。Zhang等[31]采用小鼠心脏缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤模型，观察到FUNDC1通过调控线粒体质量和血小板活性发挥保护效应。长时间缺血造成心脏缺氧，进而引发FUNDC1介导的线粒体自噬激活，降解受损线粒体并降低血小板活性。其中血小板活性降低对I/R损伤有很强的心脏保护作用。而在血小板Fundc1基因敲除的I/R模型中，血小板对低氧敏感性降低，线粒体活性持续降低引起更为广泛的心脏I/R损伤[32]。由此可见，缺氧时血小板中FUNDC1介导的线粒体自噬可保护心脏免于I/R损伤的恶化，提示通过低氧或药理学方法促进线粒体自噬可能是防治I/R的新策略。

新近资料证实，FUNDC1可通过与肌醇1,4,5三磷酸2型受体(inositol 1,4,5-trisphosphate type 2 receptor，IP3R2)相互作用促进线粒体相关ER膜(mitochondria-associated ER membranes，MAMs)稳定，并调节ER释放钙离子进入线粒体和细胞质[33]。其中，MAMs是线粒体与ER连接的接触点[34]，且在维持钙平衡中发挥重要作用[35]。FUNDC1可调控MAMs的形成和维持，而MAMs上FUNDC1-IP3R2轴的破坏会促进心力衰竭的发展[33]。敲除小鼠心肌细胞Fundc1基因引起细长线粒体数量增加，功能失调线粒体累积进而抑制心脏功能。超声心动图下表现为心脏收缩及舒张功能障碍，病理学显示心肌间质纤维化改变，心脏应激基因表达谱增高，包括心钠肽、脑钠肽等。当给予急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)处理，Fundc1敲除小鼠较Fundc1野生型小鼠的心力衰竭表现进一步恶化，且存活时间更短，死亡率更高。进一步研究表明，AMI很可能通过抑制MAMs形成而加剧Fundc1敲除小鼠心力衰竭进程。在对人类心力衰竭患者的观察中发现，患者体内FUNDC1信号降低，其介导的MAMs形成被显著抑制。这支持FUNDC1和MAMs参与心力衰竭发展的观点。因此，重建MAMs特有功能可能是治疗心力衰竭的一个新靶向。

2.2 FUNDC1与肿瘤 肿瘤是由恶性细胞无限制增生所致，由于恶性细胞迅速分裂生长需要大量能量，线粒体作为提供能量的细胞器参与了肿瘤的发生与发展过程。有报道指出，宫颈癌细胞中FUNDC1表达相较宫颈癌中癌旁组织明显增强，且FUNDC1高表达与宫颈癌患者预后呈负相关，可作为总生存及无病生存的独立预后因子[36]。进一步通过短发夹核糖核酸沉默FUNDC1表达，能明显抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，并增强细胞对顺铂和电离辐射敏感性。提示FUNDC1可作为宫颈癌患者预后的生物标记物，并可能成为改善放化疗抗肿瘤效果的新治疗靶向。

此外，Wu等[37]采用免疫组织化学观察到，乳腺癌上皮组织胞浆与核膜FUNDC1表达较正常乳腺上皮更强。Kaplan-Meier生存分析显示，FUNDC1高表达患者预后更差。FUNDC1功能获取与缺失的体外实验显示，FUNDC1明显刺激乳腺癌细胞增殖、转移及侵袭。进一步上调FUNDC1水平可促进活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1)的核转位与活性。核NFATc1与BMI1癌基因启动子结合并转录上调其表达，其中BMI1过表达可挽救FUNDC1功能的缺失。体内FUNDC1与BMI1共表达的乳腺癌患者预后较无一表达患者更差。说明FUNDC1可能通过激活Ca2+-NFAT-BMI1轴以促进乳腺癌进展，而该途径有望成为乳腺癌治疗的新靶标。

2.3 FUNDC1与炎症性疾病 有报道称各种内外因素可通过改变线粒体自噬水平来调控多种炎症性疾病(如脓毒症、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤、神经退行性疾病等)的发生与发展[38]。这种调控作用依赖于通过线粒体自噬消除过量的线粒体ROS及损伤相关分子模式，从而减轻减轻炎症反应。FUNDC1作为线粒体自噬的重要受体，目前关于其与炎症性疾病的研究尚少。有新近研究指出，在FUNDC1敲除的肝细胞中，功能失调的线粒体大量聚积，线粒体DNA释放增加，半胱天冬酶1活化增强，进而导致促炎细胞因子(如白介素1β)的释放增加，肝细胞出现过度增殖[39]，表明FUNDC1介导的线粒体自噬通过抑制炎性小体活化的方式参与调节与肝细胞癌相关的炎症反应，进而抑制肝癌发生。

脓毒症作为典型的炎症性疾病，是由感染引起宿主反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍[40]。前期研究发现，脓毒症晚期炎症因子——高迁移率族蛋白B1能够诱导T淋巴细胞功能异常、线粒体膜电位改变和细胞凋亡的发生，这种改变与Parkin线粒体受体蛋白Mfn2的表达改变密切相关[41-42]。另在小鼠盲肠结扎穿孔模型中，Pink1和Parkin敲除小鼠的器官损伤程度及死亡率较野生型小鼠更为严重[43]。提示线粒体自噬可能参与了脓毒症的致病过程。而在脓毒症状态下经常诱发心肌受损，心肌收缩力下降、心搏量降低、心肌酶水平升高，最后导致心力衰竭[2]。前文已述，FUNDC1调控MAMs与钙平衡及心力衰竭进展密切相关[34]。故FUNDC1及其介导的线粒体自噬可能参与了脓毒症心功能障碍乃至脓毒症免疫麻痹的病理生理过程。Yan等[44]给予脓毒症小鼠吸入2% 氢气(hydrogen，H2)后发现，与脓毒症组比较，2% H2处理组小鼠7d生存率、呼吸控制率与LC3-Ⅱ的表达水平升高，肝组织学评分与谷丙转氨酶及谷草转氨酶水平降低；而采用FUNDC1抑制剂细胞穿透肽P处理脓毒症小鼠能明显逆转2% H2的治疗效果效应，表明2% H2可通过调节FUNDC1介导的线粒体自噬有效改善脓毒症所致的肝功能损伤。然而，目前关于脓毒症状态下FUNDC1介导的线粒体自噬的研究尚少，其确切机制仍需深入探讨。

3 结 语

总而言之，线粒体自噬与人体健康及疾病密切相关，尽管目前已对不同的自噬信号分子做了大量研究，但其关键调控途径尚有待澄清。而FUNDC1作为一种新型线粒体自噬受体蛋白，其确切调节机制仍需更加深入探讨，尤其是相关激酶、磷酸化机制，及其在各类疾病致病过程中的作用及意义等。深入了解线粒体自噬的调控机制与关键环节，掌握其在相关疾病中的作用，将为疾病的防治提供新策略。