细胞胀亡的检测方法

潘颖星，黎 骊综述，薛 薇，阳 洁审校

0 引 言

细胞死亡对于组织发育和机体稳态来说十分重要，同时也是生命基本过程之一。目前已知，细胞死亡方式包括凋亡、自噬、旁凋亡、胀亡、焦亡等[1-2]。其中，细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动性死亡过程，主要表现为细胞萎缩和核碎裂[3-5]。许多药物可通过诱导细胞凋亡的方式来发挥抗肿瘤作用，但凋亡耐药的发生也导致药物未能产生理想效果。细胞凋亡这一细胞死亡方式已研究得较为深入、透彻，也具有较为成熟的检测方法。细胞胀亡是一种被动性的细胞死亡方式，可由生物不相容的物理条件或化学试剂的非特异性毒性引起[6]，主要表现为细胞肿胀和细胞核溶解[3-4]。近年来的研究表明，细胞胀亡是细胞死亡的一种重要方式，许多化合物如黄连素、青蒿酯、茄边碱可诱导细胞胀亡的发生。细胞胀亡不同于细胞凋亡，因此对于凋亡耐药或凋亡通路缺陷的肿瘤，诱导细胞胀亡有望能克服其耐药性以及发挥抗肿瘤作用，有助于凋亡耐药问题的克服、抗肿瘤新靶点的探索以及抗肿瘤新策略的发现。此外，细胞胀亡也参与了心血管疾病等的发生发展[7-9]，对心血管疾病等的治疗具有潜在的意义。

虽然细胞胀亡的现象早已有报道，但至今对其研究仍未深入与全面，对于细胞胀亡仍然没有标准的检测方法。目前细胞胀亡的检测主要还是以细胞形态学改变为基础，同时辅以胀亡相关的生化改变等方面的内容。目前有较少文献对细胞胀亡现有的检测方法进行总结，因此本文就相关文献进行整理与归纳，对现有细胞胀亡检测方法的原理和优缺点等进行阐述，以供参考，也期望未来能有对这一细胞死亡方式更为明确、标准的检测方法，为该领域的研究提供支撑。

1 细胞胀亡的概念和特点

1995年，Majno等[3]提出了胀亡(oncosis)这一细胞死亡方式的命名，并认识到细胞胀亡是有别于细胞凋亡的另一种细胞死亡方式，认为细胞胀亡是一种细胞膜通透性增加、细胞膜完整性破坏、DNA裂解为非特异性片段、最后细胞溶解并伴有炎症反应的细胞死亡过程，主要表现为细胞肿胀、细胞核溶解。

细胞胀亡是一种不同于细胞凋亡的细胞死亡方式，具有一些与细胞凋亡截然相反的特点，这些特点对细胞胀亡的检测起到十分重要的作用。

胀亡细胞的形态学表现为细胞肿胀，细胞体积变大；胞膜局部向外隆起呈泡状，生成的膜泡内主要含液体，不含细胞器；线粒体肿胀，内质网发生扩张[10]；细胞核内染色质分散，或在核膜和核仁周围凝集，后期发生核溶解；细胞膜通透性增加，细胞膜完整性被破坏；细胞内容物发生溶解、外溢，致使细胞周围产生明显的炎症反应。而凋亡细胞的形态学表现为细胞体积缩小，排列分散；染色质凝集、核碎裂；胞膜凹陷分割而产生凋亡体[11-13]；凋亡的膜泡中常有细胞器的存在；早期凋亡细胞的细胞膜保持完整，无周围炎症反应[14]。可见凋亡细胞与胀亡细胞两者具有不同的形态学特点，这对于胀亡细胞的诊断起重要的作用。

除了形态学特点之外，胀亡细胞还具有其他生物学特点。胀亡细胞的细胞膜完整性被破坏，细胞内乳酸脱氢酶、细胞内容物释放出细胞外[15-16]，而早期凋亡细胞的细胞膜仍保持完整性，无内容物的泄漏；在琼脂糖凝胶电泳中，由于凋亡细胞的 DNA裂解成180～200 bp或规律的、多倍长度的DNA片段而呈现出典型的DNA电泳梯带，然而细胞发生胀亡时，DNA降解为大于1000 bp、无规律、长度不等的DNA片段，无典型的 DNA电泳梯带，但也存在部分不出现梯形条带的细胞凋亡和出现梯形条带的细胞胀亡情况[17]；细胞凋亡是一种耗能的主动过程，而细胞胀亡是一种低耗能或不耗能的被动过程，由同一种刺激引起的细胞死亡，在ATP供应充足时细胞发生凋亡，ATP缺少时细胞发生胀亡[18]。

这些细胞胀亡的特点有助于细胞胀亡的判断和检测。

2 细胞胀亡的检测方法

2.1 细胞形态学检测 目前主要还是按照大多数学者所接受的形态学标准诊断胀亡细胞。常用的方法是使用光镜、时差显微镜、电镜和荧光显微镜观察细胞形态以及包括细胞核、细胞器、细胞膜等在内的细胞超微结构的改变。

2.1.1 光镜观察 即采用光学显微镜观察胀亡细胞的形态学变化，镜下可观察到胀亡细胞出现细胞肿胀、胞膜起泡、细胞质空泡化等现象。此法操作简易、结果直观、成本较低、无需特殊仪器设备，但很难对同一个视野下的细胞进行时间点的观测，且主观性大，对结果的判定缺乏特异性指标。

2.1.2 时差显微镜观察 采用时差显微镜对胀亡细胞进行实时观察与拍摄，此方法的优点在于细胞培养与显微镜观察拍摄均在一个体系内，无需移动细胞，因此可对同一个视野下的细胞或单个细胞进行各个时间点形态学的观察，更易于观察胀亡细胞的形态学变化及了解胀亡细胞的形态学特点，特别是对细胞肿胀、细胞膜起泡、细胞膜破裂现象的观察。且此法不需标记细胞或破坏细胞，可观察到细胞真正的生长状态，对细胞的生长过程做出动态的监测和分析。此法优于普通光学显微镜观察。

2.1.3 电镜观察 胀亡细胞的细胞超微结构变化已在上文中有所描述。透射电镜可观察到普通光镜观察不到的细胞超微结构，能清晰观察到细胞形态、细胞膜、细胞核和包括线粒体、内质网等在内的细胞器变化或受损情况，是判定细胞死亡方式非常重要的一种方法。对于胀亡细胞而言，透射电镜观察是一种必不可少的检测方法。有研究采用扫描电镜观察胀亡细胞的三维结构变化，发现细胞体积增大，微绒毛部分退化或缩短直至完全消失，大小不一的膜孔形成，孔洞下的细胞骨架样结构消失，细胞膜严重脱落并露出细胞核[19]。对于胀亡细胞而言，扫描电镜从立体角度展现胀亡细胞的结构变化，是对透射电镜结果的有力验证。由于形态学结果具有一定的局限性，不能满足定量的要求，因此还需在形态学结果的基础上联合其他的检测方法进行验证。

2.1.4 荧光显微镜观察 采用细胞核染料如Hoechst等对细胞核进行标记后于荧光显微镜下观察。对于活细胞或固定过的细胞，Hoechst染料可穿过细胞膜与DNA结合发出蓝色荧光，表现出经荧光染料染色后的细胞核形态。核浓缩和核碎裂是凋亡的特征，有研究发现经Hoechst 33258染色后，凋亡细胞可见蓝色破碎的细胞核现象，而胀亡细胞无此现象，可与凋亡细胞进行区别[20]，但当细胞存在其他死亡方式时可能会干扰该结果的判定。 另有研究采用多通道全息显微镜观察和区分胀亡与凋亡细胞，该法中的显微镜将荧光成像与全息显微术相结合，让两种方法的聚焦面处于同一位置，这使得两种方法之间可以很容易地转换，在相同的条件和几乎相同的时间点进行成像[21]。

2.2 细胞膜完整性检测 细胞发生胀亡的过程中，细胞膜通透性增加、细胞膜完整性被破坏，且有人还提出一种由膜损伤启动的细胞死亡机制假说，认为细胞膜受损启动了细胞胀亡的开关[22-23]。而细胞在早期凋亡过程中细胞膜依然保持完整性，因此可通过检测细胞膜的完整性来与凋亡进行区别。一方面即“进入细胞”方面可通过流式细胞术检测碘化丙啶(PI)、Annexin-V/PI、7-氨基放线菌素D(7-amino-actinomycin D，7-ADD)等染料进入细胞与细胞的结合情况，另一方面即“流出细胞”方面可通过检测细胞乳酸脱氢酶释放量、细胞内容物泄漏量来反映细胞膜的完整性，由此来与细胞凋亡进行区别同时验证是否具有细胞胀亡的特点，也是对电镜观察结果的进一步验证。值得注意的是，细胞膜通透性发生改变和细胞膜完整性破坏不仅限于胀亡细胞，如焦亡细胞也具有细胞膜通透性改变、细胞膜完整性破坏的特点，另外，晚期凋亡细胞同样也会有细胞膜损伤现象，因此对胀亡细胞的检测除了进行细胞膜完整性检测之外，还应联合其他方法对细胞胀亡的其他特点进行检测。

2.2.1 碘化丙啶吸收试验 碘化丙啶常用作细胞核染料。PI染料不能通过正常的细胞膜，但可通过受损的细胞膜从而对细胞核进行染色。PI通过受损的细胞膜后与DNA发生结合发出红色荧光，通过荧光显微镜和流式细胞仪观察或检测细胞对PI染料的吸收情况可反映出细胞膜的完整或受损情况，因此可用细胞对PI染料的吸收作为判断细胞膜完整性的指标。由于胀亡细胞的细胞膜受损，可吸收PI呈现出较强的红色荧光，而早期凋亡细胞的细胞膜仍保持完整性，对PI不吸收或较少吸收，因此可通过PI的吸收来与细胞凋亡进行区别或者验证是否具有细胞胀亡的特点。

2.2.2 Annexin-V/PI双染 在细胞凋亡的早期，磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，与Ca2+依赖性磷脂结合蛋白Annexin-V发生高亲和力特异性结合。使用标记了荧光素如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)的Annexin-V与PI对细胞进行双染，通过流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。有研究也将此法用于细胞胀亡的检测，即活细胞不着色(Annexin-V-/PI-)，早期凋亡细胞仅能与Annexin-V结合呈绿色(Annexin-V+/PI-)，胀亡细胞能与 Annexin-V和PI结合呈绿色和红色荧光(Annexin-V+/PI+)[24-25]。但中、晚期凋亡细胞也可呈现出绿色和红色荧光(Annexin-V+/PI+)，因此仅凭流式细胞术这一结果还无法说明细胞胀亡的发生，但对细胞凋亡的检测和排除具有一定的作用。

2.2.3 7-ADD染色 7-ADD染料可以通过破损的细胞膜进入细胞与核酸结合，有研究通过流式细胞仪检测7-ADD与细胞的结合情况，发现细胞膜破损的胀亡细胞表现出强力的7-ADD掺入现象[26]。但7-ADD染色的结果对于细胞胀亡而言仍不具有特异性。

2.2.4 乳酸脱氢酶释放试验 发生胀亡的细胞由于细胞膜通透性发生改变、细胞膜受损或破裂，此时细胞内乳酸脱氢酶可释放到细胞外[15]，因此上清中有较多乳酸脱氢酶的存在。通过对乳酸脱氢酶释放量的检测可反映细胞膜受损情况，有助于对细胞胀亡的判定。

2.2.5 细胞内容物泄漏试验 细胞内容物的泄漏是细胞膜受损的一个特征[16]，胀亡细胞由于细胞膜通透性发生改变、细胞膜受损或破裂，此时细胞内容物可从细胞中泄漏，泄漏的内容物对260 nm波长具有一定的吸收。通过对细胞内容物泄漏量的检测也可反映细胞膜受损情况，有助于对细胞胀亡的判定。

2.3 DNA梯形带检测 琼脂糖凝胶电泳实验也可在一定程度上证明胀亡的存在。细胞发生凋亡时，Ca2+、Mg2+依赖型核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活，将 DNA 降解。由于凋亡细胞会断裂成180～200 bp大小或其倍数的DNA片段，因此在琼脂糖凝胶电泳结果中呈现典型的梯形条带；而胀亡细胞DNA裂解成弥漫性随机片段，电泳结果呈现出随机性电泳条带，可与细胞凋亡进行区别。但需注意的是，其他细胞死亡方式的存在会对该结果的判定产生一定的干扰性。

2.4 线粒体膜电位检测 线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,Δψm)是由线粒体内膜两侧质子或其他离子分布不均一而形成。线粒体膜透化作用包括孔洞或通道的形成，可导致线粒体膜电位的耗损，不少研究报道细胞胀亡与细胞线粒体膜电位的下降有关[2, 16]。线粒体膜电位的检测可使用JC-1染料，JC-1具有膜电位依赖性而存于线粒体中。在线粒体膜电位较高的情况下，JC-1形成聚合物可聚集于线粒体的基质中，发出红色荧光；而在线粒体膜电位较低的情况下，JC-1表现为单体并无法聚集于线粒体的基质中，发出绿色荧光。从荧光颜色的转变可反映出线粒体膜电位的变化，相关指标为红绿荧光颜色的比例。除了JC-1这一染料，罗丹明123也可用于线粒体膜电位的检测。值得一提的是，细胞线粒体膜电位的下降不仅仅与胀亡相关，细胞凋亡和其他细胞死亡方式同样也存在细胞线粒体膜电位下降的现象，故对于细胞胀亡而言，细胞线粒体膜电位的检测不具有特异性，还需联合其他的方法进行检测。

2.5 细胞ATP水平检测 细胞凋亡和细胞胀亡的一个有趣的区别是，它们分别是ATP依赖和ATP非依赖的过程。细胞凋亡是一种需要消耗ATP的主动耗能过程，而细胞胀亡不需要ATP的消耗便可发生，在 ATP不足的情况下补充ATP后，细胞可由胀亡转向凋亡[18]，因此细胞内ATP含量的检测在证明细胞胀亡或区别细胞凋亡与细胞胀亡中具有重要作用。细胞ATP含量的检测可使用ATP检测试剂盒来进行检测。ATP检测试剂盒原理是萤光素经萤火虫萤光素酶催化产生萤光的这一过程需要ATP的能量供给，在底物与酶均过量的条件下，萤光的产生与ATP的浓度呈正相关，因此可通过萤光强度反映细胞ATP含量。另外也有采用其他原理如磷钼酸比色法的ATP检测试剂盒，肌酸和ATP受肌酸激酶催化后，反应生成磷酸肌酸，检测磷酸肌酸含量也可反映ATP的含量。值得注意的是，细胞ATP含量的检测对于细胞胀亡而言亦无特异性，还需联合其他的方法进行检测。

2.6 细胞质钙离子浓度检测 细胞胀亡的发生与细胞质钙离子浓度的升高有关，钙离子浓度可影响钙依赖性的calpain蛋白酶的激活以及作为调节线粒体膜通透性的另一机制。对细胞内钙离子浓度的检测可以使用对钙离子敏感的Fluo-3/AM 荧光染料，Fluo-3/AM 可结合细胞质中游离的钙离子并发出绿色荧光，通过流式细胞仪进行检测荧光强度从而反映钙离子浓度。同上，钙离子浓度的检测对于细胞胀亡而言无特异性，需联合其他方法。

2.7 细胞ROS水平检测 生理水平的ROS可以作为信号分子调控转录，但过量生产的ROS会导致氧化应激，破坏细胞内分子和细胞器，最终导致坏死。近年来有多篇文献报道了细胞胀亡与ROS的过量生成相关，如有研究发现青蒿琥酯可诱导胰腺癌细胞死亡，其机制是由ROS介导的细胞胀亡死亡方式[20, 24]。对细胞内活性氧ROS水平的检测可使用荧光探针DCFH-DA。其原理是无荧光性的DCFH-DA可透过细胞膜，DCFH被ROS氧化成具有荧光性的DCF，从而由原本的无荧光性变成具有荧光性。DCF的荧光强度可反映细胞内ROS的水平。同上，细胞内ROS水平的检测对于细胞胀亡而言无特异性，需联合其他方法。

2.8 细胞胀亡相关蛋白的检测 通过Western blot实验检测porimin和calpain蛋白的表达情况。

porimin也被称为促胀亡受体。据研究报道，抗porimin蛋白可以迅速诱导T细胞白血病细胞Jurkat细胞经历一种独特的细胞死亡形式，出现细胞聚集、形态改变、细胞膜孔形成和膜泡生成、细胞膜通透性改变等现象，与胀亡的特点相吻合，又采用免疫印迹和免疫共沉淀等方法发现了一个110 kDa的细胞表面受体，由此用抗porimin蛋白定义了这个介导细胞胀亡的细胞表面受体为porimin[27]。porimin蛋白的检测对于细胞胀亡的判定具有重要作用，但仅对porimin蛋白的表达情况进行检测，方法过于单一，应加上形态学及其他检测方法，更具说服力。

calpain是一种钙依赖性的中性蛋白酶，已发现的哺乳动物calpain蛋白酶家族成员共有14个，可分为组织特异型和非组织特异型。非组织特异型的两个亚型，μ-calpain和 m-calpain可分别由微摩尔和毫摩尔的钙离子浓度激活[28]，calpain 1和calpain2分别为μ-calpain和 m-calpain。虽然不少研究表明calpain在细胞胀亡中起着重要作用，如有研究使用calpain抑制剂后可阻止细胞胀亡，但目前尚不清楚calpain的亚型与细胞胀亡的关系，对calpain 1与calpain 2的检测均有胀亡相关的研究报道。鉴于calpain蛋白在细胞胀亡中起着关键作用，故应与porimin蛋白一同检测。

2.9 排除法

2.9.1 Annexin-V/PI双染联合Western blot的排除法有研究进行Annexin-V/PI双染，并通过Western blot实验检测了凋亡关键蛋白caspase-3和caspase-3底物PARP-1这两者剪切形式的表达情况，发现随小檗碱浓度的增加，坏死和晚期凋亡的细胞数量也明显增加，但剪切型caspase-3和PARP-1的表达并没有增加，说明小檗碱没有激活caspase-3和PARP-1，没有启动凋亡，该法对细胞凋亡起到一定的排除作用[29]。

2.9.2 使用泛caspase、自噬、坏死抑制剂的排除法有部分研究通过加入泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK、坏死抑制剂Necrostatin-1或自噬抑制剂3-MA[30-31]，观察这些抑制剂能否阻止药物引起的细胞死亡，由此排除药物引起的细胞死亡经由凋亡、自噬、坏死途径，接着在形态学的基础上继续探究细胞死亡是否由胀亡引起。该法在一定程度上能排除凋亡、自噬、坏死的方式，但也存在一定的缺陷，如不依赖caspase的凋亡、不经由RIP1/3通路的坏死这类特殊情况无法排除，且也有研究者采用该法来研究旁凋亡，故此法不具有特异性，仍需联合其他方法。还有研究加入泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK后观察是否能抑制药物引起的细胞肿胀和空泡化现象，结果发现泛caspase抑制剂Z-VAD-FMK不能阻止药物引起的形态学变化，说明细胞肿胀和空泡化现象并不是由caspase依赖性凋亡引起，具有一定的排除作用[16]。

2.10 实时流式细胞术动力学分析法 有研究采用一种测量线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)和细胞膜电位(plasma membrane potential，PMP)变化的实时流式细胞术动力学分析方法来区别凋亡细胞和胀亡细胞[32]。即用染料DiIC1(5)和DiBAC4(5)分别标记检测细胞的线粒体膜电位和细胞膜电位，并结合Annexin-V- FITC和DAPI染料通过流式细胞仪进行检测。研究结果发现，细胞凋亡过程中的持续25 min内MMP和PMP信号变化不大，线粒体仅出现轻微的超极化；而加入诱导胀亡的化学试剂后立即导致超极化峰，随后在25 min的过程中MMP完全耗竭且PMP也发生去极化，与细胞凋亡截然不同，根据这特点可将凋亡细胞与胀亡细胞进行区别。这种新型实时快速流式细胞术分析线粒体功能变化和质膜去极化的新方法使得标准化流式细胞术可用于细胞胀亡的实时化研究，也使得细胞胀亡在线粒体膜电位和细胞膜电位方面的特点随之被发现。

3 结 语

了解不同的细胞死亡方式对于制定有效措施来阻止相关疾病的发生发展和改善由细胞死亡引起的人类疾病至关重要。胀亡有别于凋亡，是重要的细胞死亡方式之一，越来越多的药物也被发现具有诱导细胞胀亡的作用，细胞胀亡是一个亟待深入探索的研究领域。但目前对于细胞胀亡仍没有标准的检测方法，且胀亡与其他的死亡方式存在着部分共同点，因此单独一种检测方法无法说明细胞胀亡的发生，需几种方法的联合使用以证明，但无论如何，细胞形态学观察为主要。细胞胀亡检测方法选择的不统一性在一定程度上限制了研究者们对胀亡的研究，希望未来能有对这一细胞死亡方式更为明确、统一、准确性高、特异性强的检测方法，为系统、深入地研究细胞胀亡在肿瘤发生发展中的作用、探索潜在的抗肿瘤靶点以及研究胀亡参与其他疾病的病理机制等方面提供支撑。