儿童神经母细胞瘤实验诊断学的研究进展

张培培，杨毅，侯丽英，张晓红，孟丽娜，沈永明

(1.天津市儿童医院检验科，天津300134;2.天津中医药大学，天津301617)

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)起源于交感神经系统，由未分化的神经母细胞导致，主要发生于5 岁以下儿童，占儿童恶性肿瘤的8%～10%，男性发病率略高［1］。与其他肿瘤相比，NB 恶性程度髙，早期就可能突破肿瘤包膜侵入周围组织脏器，经淋巴或血行发生转移。NB 易复发、易转移等特点使其成为主要的致死原因［2］。由于NB 的发病机制及病情进展个体差异较大，因此需对多学科多种诊断评价系统不断进行完善，以准确评估患儿疾病情况并制订合适的治疗方案，而实验室检查对这一常见疾病的早期诊断、预后判断及评估有重要意义。其中，尿儿茶酚胺及其代谢物的检测为最经典的实验室诊断方法，且联合多种肿瘤标志物指标诊断价值更高。骨髓活检或涂片对NB 肿瘤细胞在确定病变范围及临床分期上有重要作用［3］。另外，随着细胞生物学及分子生物学的迅猛发展，染色体的改变和一些具有潜在诊断价值的分子逐渐被发现，它们在NB 预后判断和评估等方面有重要意义。现就儿童NB 实验诊断学的研究进展予以综述，以期为NB 的临床诊断提供依据。

1 肿瘤标志物检测

1.1 儿茶酚胺及其代谢物 NB 具有合成、分泌儿茶酚胺的特点，香草扁桃酸、高香草酸是儿茶酚胺的终末代谢物，故NB 患儿早期尿中香草扁桃酸、高香草酸排出较多，其诊断特异度分别为95.1%和95.8%［4］。对于年龄较小NB 患儿留取24 h 尿比较困难，可取某一段时间的尿测定香草扁桃酸或高香草酸与尿肌酐的比值作为评价指标。肌酐是肌酸的代谢终产物，由肾脏排泄，人体内源性肌酐每日生成量几乎恒定，24 h 尿肌酐排泄量也是恒定的［5］。3-甲氧酪胺是多巴胺的甲基化产物，NB 患者尿中3-甲氧酪胺水平明显升高。3-甲氧酪胺的诊断效果与多巴胺和高香草酸相似，其水平与疾病的活动度有良好的相关性，可作为肿瘤标志物用于NB 的诊断和监测［6］。甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素分别是肾上腺素和去甲肾上腺素的中间代谢产物，它们在血浆中半衰期较长，血浆浓度波动较小，特异性和敏感性均优于儿茶酚胺测定。有学者对301 例NB 患者的8 种尿儿茶酚胺代谢物(香草扁桃酸、高香草酸、3-甲氧酪胺、多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素)进行研究发现，儿茶酚胺代谢产物水平升高，其中3-甲氧酪胺与NB 的分期、年龄、MYCN 扩增、1p 杂合性丧失和骨髓侵袭等特征相关，甲氧基去甲肾上腺素是最敏感的单一代谢物，其诊断灵敏度为89%，当8 种代谢物联合使用时，诊断灵敏度达95%［7］。除尿儿茶酚胺代谢产物检测外，也有学者研究了血浆中甲氧基肾上腺素、甲氧基去甲肾上腺素和3-甲氧酪胺在NB 诊断中的作用，结果发现3-甲氧酪胺和甲氧基去甲肾上腺素表现出良好的诊断性能，其特异度分别为100%和95.8%，灵敏度分别为88.2%和80.4%;且该研究还发现，血浆甲氧基去甲肾上腺素与尿甲氧基去甲肾上腺素水平呈正相关［8］。

1.2 神经元特异性烯醇化酶 神经元特异性烯醇化酶是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶，由神经母细胞合成，是免疫组织化学染色的重要指标。血清神经元特异性烯醇化酶是NB 的特异性负荷指标，其高水平提示预后较差，与诊断时肿瘤的最大直径呈线性相关，可间接反映患者体内肿瘤的代谢活跃度［9］。但其特异性相对较差，在胰岛细胞瘤、甲状腺髓样癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、小细胞肺癌、嗜铬细胞瘤等其他肿瘤中神经元特异性烯醇化酶也存在高表达。

1.3 嗜铬粒蛋白A 嗜铬粒蛋白A 广泛存在于神经内分泌细胞，是一种酸性单体蛋白，在高分期和转移性NB 中表达水平升高，其作为肿瘤标志物特异度为72%，灵敏度为96%［10］。另有学者在NB 细胞中使用敲除的方法减少嗜铬粒蛋白A 的表达研究NB 细胞增殖和形态学的变化，结果表明嗜铬粒蛋白A 可以维持胰岛素样生长因子分泌和细胞内的信号转导，从而促进NB 细胞的增殖和分化［11］。因此，血浆嗜铬粒蛋白A 可作为肿瘤发展进程的动态监测和预后指标。

1.4 生化指标 乳酸脱氢酶作为全身肿瘤细胞负荷的一项指标，广泛分布于肝、肾、心肌、骨骼肌、肺等多种组织、器官中，当这些组织发生病变时血清乳酸脱氢酶水平升高，但其特异性不高。血清乳酸脱氢酶可反映NB 的疾病进程，与肿瘤的体积呈正相关，可用于NB 的诊断和随访［12］。血清铁蛋白是一种急性时相反应蛋白，与铁代谢和储存密切相关。血清铁蛋白水平升高不仅见于铁负荷增加，也常见于感染、风湿或恶性肿瘤。NB 细胞快速生长与增殖，其合成铁蛋白的能力增强，故血清铁蛋白水平明显升高。Meany 等［13］指出，NB 患儿血清铁蛋白水平越高，其预后越差。C 反应蛋白是由肝细胞产生的一种急性时相反应蛋白，有文献报道，C 反应蛋白在肿瘤的良恶性鉴别、早期诊断、组织学特点、转移及治疗评估等方面均有重要作用［14］，可作为NB 的诊断和监测指标［15］，但特异性较差。因此联合检测多种肿瘤标志物，可以提高NB 的诊断率。

2 血液学检测

NB 细胞常通过血液或淋巴系统发生转移，NB患儿均有不同程度的贫血，表现为外周血全血细胞减少，多数伴有发热、淋巴结肿大、骨痛等临床症状。当发生骨髓转移时，患儿骨髓增生程度降低，活跃或明显活跃。NB 细胞形态及大小在不同病例中差异明显，其胞质丰富，胞质内可见粉红色细小颗粒，核圆形或椭圆形，多为单核，也有双核或多核，片尾可见许多瘤细胞成团聚集在一起，胞质融合，呈“菊花形团状结构”，显微镜下可见瘤细胞间有紫红色的条索状纤维丝状物质［3］，这一形态特点可作为NB与其他类型白血病的鉴别诊断依据。细胞化学染色显示，糖原染色试验多表达阳性，过氧化物酶染色结果多为阴性，因此骨髓细胞形态学观察联合细胞化学染色可提高NB 的诊断率［16］。

3 尿细胞形态学检测

尿液涂片分析技术具有无风险、无创伤等优点，仅利用患儿尿液就可做出诊断，有广阔的应用前景。Nishikawa 等［17］首次通过尿细胞学诊断NB，取尿液标本送达病理科诊断，采用液基细胞学方法并进行巴氏染色，其余标本进行吉姆萨染色。巴氏染色标本显示大小不同，高度聚集的小圆细胞，核深染，胞质稀少，未见明显菊花状结构或纤维基质;而吉姆萨染色标本表现出高核质比的细胞黏附成团簇状。免疫组织化学染色显示，肿瘤细胞对嗜铬粒蛋白A、突触素和神经元特异性烯醇化酶呈弥漫性强阳性，而对CD45、肌红蛋白呈阴性，最后组织学诊断为分化不良的NB［17］。儿童尿液细胞学检查是一种少见的恶性肿瘤检测方法，该技术可用于病例的快速诊断。

4 细胞遗传学检测

NB 是一种异质性肿瘤，可表现出多种不同的染色体异常，如癌基因MYCN 扩增、1p 缺失、DNA倍体分析和杂合性缺失［18］。其中，第1 号染色体短臂1p36 缺失、第17 号染色体长臂末端(17q23-qter)获得、11q23 缺失、14q23-ter 缺失、7q 基因获得等是比较常见的遗传学畸变。MYCN 癌基因定位于染色体2p24，约30%的NB 中可发现MYCN 扩增或MYC蛋白的表达，MYCN 基因扩增与不良预后有关，其表达特征可以作为高危NB 的生物标志物［19］。有学者利用荧光原位杂交技术检测154 例NB 患儿MYCN基因的扩增发现，MYCN 的表达与年龄、NB的临床分期及分型、核分裂-核碎屑指数高低和组织学预后分组等显著相关，而与性别无关［20］。在患儿危险因素分期中，染色体倍数分析对预后有重要的提示意义，超二倍体或三倍体预后良好，多见于婴儿和早期NB，而近二倍体或四倍体预后欠佳［21］。

5 流式细胞免疫分型

流式细胞术是一种生物学技术，可以对异质细胞群的逐个细胞进行快速、定量、多参数分析，目前已运用于肿瘤学、细胞生物学、免疫学、基础医学及临床检验等领域。其中，免疫分型是使用抗体对异质细胞群表达的抗原，即标志物进行分析，以鉴定目标细胞群的存在及比例。流式细胞免疫分型能够及早发现免疫学标志物，对NB 的诊断有重要意义。NB 细胞来源于分化差的神经节细胞，其表面有CD13、CD15、CD56、CD117 表达，而不表达CD45［22］。CD45 是白细胞的共同抗原，所有造血细胞均表达，但NB 细胞株不表达，说明其为非造血系统来源。CD81分布于大多数淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表面，血小板不表达，但人类NB 细胞株表达。GD2 是NB的特异性标记，其特异性高于CD45、CD56、CD81，现阶段应用较多。有文献报道，靶向GD2 的嵌合抗原受体转染人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞后，对GD2 阳性的NB 细胞具有杀伤作用［23］。因此，GD2 可作为NB 治疗的一个靶点。CD44 与MYCN的扩增呈负相关，CD44 表达且无MYCN 扩增提示预后良好，而CD44 失表达提示预后差［24］。

6 分子生物学检测

肿瘤细胞在发生发展的各个阶段均可以产生一些具有生物活性的小分子物质，这些物质可以被用于NB 诊断及预后的判断。

6.1 非编码RNA 人类基因组的30 亿个碱基对中，有98.5%的核苷酸序列为非蛋白质编码序列，因此非编码RNA 在很长一段时间内被认为是生物学“噪音”。近年来，随着生物信息学的蓬勃发展，基因芯片、二代测序及各种分子生物学实验技术的应用，大量具有生物学功能的非编码RNA 被发现，具有代表性的为微RNA(microRNA，miRNA)和长链非编码RNA［25］。miRNA 广泛存在于真核生物体内，其通过参与肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭及转移等过程而调控NB 的进程［26-27］，血中循环miRNA 对NB 的诊断具有重要提示作用。miR-483-3P 通过下调其靶基因RIO 激酶3 表达，促进NB 的增殖、侵袭和迁移，从而发挥促癌基因的作用［28］。过表达miR-497 可诱导MYCN 扩增细胞系凋亡，抑制肿瘤细胞生长，降低血管通透性。miR-497 可以靶向与细胞周期、生存和血管生成相关的多个基因，成为NB 诊疗的一个候选分子［29］。miR-124 在NB 中低表达，与NB 细胞的分化有密切关系［30］。let-7 基因缺失在NB 中很常见，与MYCN 扩增负相关，可作为不良预后的独立预测因子［31］。长链非编码RNA 的长度超过200 个核苷酸，其可通过基因表达的调控及表观遗传学等调控影响肿瘤的发生发展［32］。有研究表明，长链非编码RNA SNHG7 在NB 细胞中高表达，它可以作为miR-653-5p 的海绵与miR-653-5p结合，调节其下游靶基因信号转导及转录激活因子2的表达，进而促进NB 细胞增殖、侵袭转移及上皮-间充质转化［33］。Mazar 等［34］发现，MYCN 扩增和非扩增的NB 细胞系中GAS5 的表达水平均较高。体外抑制GAS5 可导致细胞增殖缺陷、凋亡和细胞周期阻滞。他们进一步分析GAS5 克隆发现多个剪接变异，证明GAS5 以长链非编码RNA 剪接变异体的形式对NB 细胞增殖和凋亡进行调控，从而为NB 的诊疗提供新靶点。

6.2 酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor，Trk)家族 Trk 家族是一组神经营养因子受体，包括TrkA、TrkB 和TrkC，其配体分别为神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养素-3［18］。研究表明，Trks 家族对NB 的预后有诊断作用［35-38］。TrkA 可促进神经元分化，其高表达与NB 肿瘤良好的生物学行为相关，TrkA 受体与MYCN 基因扩增呈负相关［35］;而TrkB 与配体结合促进NB 细胞的恶性增殖，其多表达于MYCN 基因扩增的侵袭性NB 中，是预后不良的指标［36］。有文献报道，磷脂酰肌醇-3-激酶和促分裂原活化的蛋白激酶通路介导了TrkB/脑源性神经营养因子对NB 细胞的转移和侵袭作用［37］。TrkC 与配体结合可诱发肿瘤细胞的凋亡，抑制NB细胞的恶性增殖与侵袭转移［38］。

6. 3 间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)和配对同源异型盒蛋白2B(paired-like homeobox 2B，PHOX2B) 目前，在遗传性NB 中研究较成熟的为ALK 基因和PHOX2B［18］。ALK 被认为是NB 的易感基因，其异常主要表现为点突变、基因扩增及蛋白表达增加，ALK 在进展期NB 中有过表达现象，特别是伴MYCN 扩增时，提示预后差。有文献报道，ALK 直接靶定MYCN 基因促进NB 的侵袭和转移［39］，且活化的ALK 受体可以作为ALK 基因的抑制剂，应用于临床对肿瘤的靶向治疗［40］。在家族性NB 中，2.3%～6.4%的患儿发生PHOX2B基因突变，但在散发性患儿中偶见［41］。此外，进展期NB 中易检测到PHOX2B 突变，并提示骨髓受累及预后不良［42］。PHOX2B 是NB 微小残留疾病的标志物，肺微转移的NB 细胞中PHOX2B 的表达水平明显高于肺宏观转移细胞，在裸鼠肾上腺原位接种敲降PHOX2B 的微转移NB 细胞发现，裸鼠腺体原位肿瘤明显增大，体重增加，肺和骨髓微转移负荷明显增加，提示PHOX2B 具有抑制NB 转移的作用［43］。

6.4 HuC/D Hu 家族蛋白是一种RNA 结合蛋白，又称类胚胎致死异常视觉家族，Hu 家族包括HuB、HuC、HuD、HuR 4 个成员［44］。HuC/D 在神经元中特异性表达，参与了神经元分化和神经系统的维持。Takemoto 等［45］评估了85 个NB 和101 个其他小圆细胞肿瘤和神经内分泌肿瘤，在免疫组织化学中HuC/D 的免疫反应性采用总评分(TS 范围:0 ～8)进行半定量分析，TS≥6 为阳性。除嗜铬细胞瘤外，NB 的TS(均值7.94)明显高于其他小圆细胞瘤和神经内分泌肿瘤(P ＜0.001);且在所有NB 和嗜铬细胞瘤中PHOX2B 均呈阳性。因此，作为一种高度敏感的诊断标志物，HuC/D 可以将NB 与其他小圆细胞瘤区分开来。此外，HuC/D 结合PHOX2B 染色对NB 具有诊断价值。

7 小 结

NB 作为儿童颅外实体性肿瘤中最常见的恶性肿瘤，其临床表现多样，易误诊漏诊或诊断时已发展至晚期。因此，对NB 的早期诊断显得尤为重要。实验室诊断作为NB 诊断的一项辅助手段，对判断肿瘤负荷、治疗效果及预后评估具有十分重要的意义。近年来，在高科技技术的推动下，各个学科相互渗透，NB 的诊疗已进入分子生物学领域，许多肿瘤相关分子及信号通路的调控模式不断被发现，这些基因分子预测指标成为NB 诊断研究的新热点，并为未来基因的靶向治疗提供重要依据。