环状RNA在肿瘤中的研究进展

李 勇 郭 敏

癌症高发生率及高病死率已经成为制约人类生活质量的公共卫生事件。由于大多数肿瘤的病因复杂，给后续的诊治带来困扰。然而环状RNA因其丰富的生物学功能逐渐进入人们的视野，并在肿瘤学领域掀起了一股研究热潮，最近研究发现环状RNA在肿瘤组织及体液中存在差异性表达，除了参与并介导甲状腺癌、肝癌、白血病等多种肿瘤的增殖、浸润、迁移等恶性病理过程，在辐射及化疗药物作用下发挥增敏或抗性作用。

一、环状RNA的研究进展及结果

根据主要历史事件及重大成果，环状RNA的研究大致可分为以下几个阶段：第1阶段：1976 年Sanger等[1]在植物类病毒中发现了一类共价闭合环状分子，首次提出环状RNA的概念，自此拉开了环状RNA研究的序幕；第2阶段：1976～2012年，环状RNA不断被发现存在于各种生物体内，由于检测工具的制约，其被认为是无功能的剪接意外的产物，未给予足够重视[2]；第3阶段：2012～2013年，环状RNA的形成机制首次得以揭示，此外其作为microRNAs海绵这一重要生物学功能被证实，环状RNA的研究自此进入高潮阶段[3]；第4阶段：2013年至今，以单分子测序技术和SMRT技术为代表的第3代高通量测序技术应用于环状RNA检测，由于存在不能重复检测、费用高等问题，限制了其应用。截止目前发现环状RNA具有丰富、稳定、保守、半衰期长、特异性高、在组织及体液中广泛存在并差异性表达等特点，但由于环状RNA的研究尚处于初级阶段，发掘其潜在的功能对于阐明肿瘤发生、发展的具体机制，作为新的有效靶点具有重要意义。

二、环状RNA的生物学功能

1.作为miRNA“海绵”：作为miRNA“海绵”发挥竞争性内源RNA机制是目前发现circRNA最主要的调节机制，circRNA可以通过与相应的miRNA靶向结合，进而调节靶基因的表达。其中circ-ITCH具有多个miRNA结合位点，可与miR-7、miR-17、miR-214、miR-22-3p靶向结合，且在宫颈癌、甲状腺癌等多种肿瘤中低表达，发挥促癌作用。此外有研究发现cESRP1可以通过海绵样吸附miR-93-5p-p21，调控相应靶基因及通路，增加小细胞肺癌化疗敏感度[4]。可见circRNA-miRNA机制除了参与肿瘤的恶性进程，还可能作为化疗药物的增敏剂，发挥正性调控作用，抑制肿瘤的进展。

2.调节亲本基因表达:研究表明，不同来源的环状RNA在不同物种中对亲本基因的调控存在差异[5]。如存在于细胞核且包含有一段或多段内含子序列的外显子来源的环状RNA EIciEIF3J和EIciPAIP2以顺式作用形式与U1小核RNA和RNA聚合酶Ⅱ结合到核糖核蛋白，促进其亲本基因的表达；而分布在细胞质中仅包含外显子的circRNA,则是通过与线性转录本相互作用间接影响亲本基因的转录。而最近一项研究发现拟南芥(arabidopsis)separalata3(SEP3)第6外显子产生的环状RNA通过形成R-环(RNA:DNA杂交)调控其亲本基因(SEP3)的表达，这是理解植物中环状RNA分子机制的第一项成果[6]。可见，环状RNA通过多样的方式调节亲本基因的表达。

3.与RNA结合蛋白相互作用:circRNAs与RNA结合蛋白(RBP)的相互作用类似于其与miRNA。本质上，一些环状RNA含有RNA蛋白结合位点，这些结合位点对某些RBP具有高亲和力，从而阻止了它们在细胞中的可用性和随后的作用。研究发现果蝇黑胃肌蛋白(MBL)是具有特殊功能的RBP[7]。过表达的MBL蛋白可促进circMBL产生而抑制其线性mRNA的产生，此外circMBL也可以通过与MBL蛋白结合抑制后者的堆积。而这一机制的产生依赖侧翼内含子序列中功能性MBL结合位点的存在。近年来研究发现，高水平的circPABPN1抑制了HuR与PABPN1的结合，HuR和circPABPN1在调控PABPN1翻译方面作用正好相反[8]。推测circPABPN1与HuR的结合阻止了HuR与PABPN1 mRNA的结合，从而降低了PABPN1的翻译，这是circRNA与其同源mRNA竞争RBP影响翻译的首例。

4.翻译蛋白质:环状RNA除了调控亲本基因的表达，还可以通过特殊的机制影响蛋白质的翻译。如部分病毒蛋白的翻译依赖于内部核糖体进入位点(IRES)和细胞免疫反应；而在真核翻译系统中，cirRNA的翻译不需要包含IRES的元素，含有小核糖体的开放性起始前复合物的结合是真核生物典型翻译过程的起始步骤。果蝇S2细胞circRNA的表达依赖于表达V5标记蛋白的内含子-外显子-内含子微基因的存在。而含有N6-甲基腺苷的环状RNA(m6A-cirRNA)在热休克应激作用下促进GFP蛋白的翻译，参与发育和细胞周期调节等过程[9]。此类具有翻译蛋白质功能的环状RNA将在不同层面上揭示人类生命活动中许多病理生理机制。

5.与癌症相关的融合circRNA(fusion-circRNAs,f-circRNA)协助肿瘤细胞“逃逸”:研究表明与癌症相关的染色体易位会产生融合环状RNA，这些融合的circRNA是由易受影响的不同基因的转录外显子产生，不在正常细胞中表达，其存在有助于细胞转化，影响细胞活力，促进细胞存活和治疗抵抗，在体内扮演癌基因的角色[10]。此外特定基因诱导的染色体易位除了产生融合蛋白和激活特定的致癌途径外，还促使新融合环状RNA的形成，且f-circRNA和circRNAs通常与线性转录体共用外显子，推测环状RNA与f-circRNA之间存在竞争关系,此外研究证实f-circRNA在染色体形成后早期出现，而不仅仅是肿瘤发生过程的产物。

6.作为传播媒介:研究证实circRNA 在人体体液中大量存在并发挥促癌作用，如其在子宫内膜癌患者血清细胞外囊泡(EVs)的浓度高于健康对照组，提示其可作为一种信息载体，在细胞内及细胞间传递信息[11]。进一步研究这些EV-carried circRNAs的作用将有助于揭示肿瘤侵袭、转移的潜在机制。此外最近研究发现，植物circRNAs有可能作为信号分子通过木质部和韧皮部在细胞间长距离传递，这一发现将拓宽circRNA作为信息分子的应用范围[12]。

三、环状RNA与各系统肿瘤

1.环状RNA与呼吸系统肿瘤

环状RNA与肺癌：近年来研究发现，失调的环状RNA在肺癌的恶性进展、化疗耐药等中发挥重要作用。Zhou等[13]研究发现，hsa-circ-0004015在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)组织中明显高表达，且其表达量与NSCLC生存率呈负相关，敲除hsa-circ-0004015可显著降低细胞的活力、增殖和侵袭能力,此外hsa-circ-0004015/miR-1183/PDPK1轴调控NSCLC的增殖、侵袭和耐药，提示其潜在的诊断及治疗价值。同样Zhu等[14]研究发现hsa-circ-0013958在肺腺癌组织、细胞和血浆中均上调，功能实验证实hsa-circ-0013958通过结合miR-134，上调癌基因cyclinD1，进而促进肺腺癌的恶性进展，提示hsa-circ-0013958有望成为肺腺癌新型无创筛查指标。

2.环状RNA与消化系统肿瘤

(1)环状RNA与肝癌：Wei等[15]研究发现circ-CDYL在早期肝癌组织较中晚期肝癌组织显著高表达，其一方面通过结合miR-892a和miR-328-3p，促进相应的下游靶基因表达而激活肝癌相关的通路发挥促癌作用。另一方面增加上皮细胞黏附分子(EPCAM)+的肝癌起始细胞(T-ICs)比例，促进肝癌细胞的自我更新、恶性增殖、抗药性和成瘤特性。此研究揭示了circ-CDYL作为新型分子，在肝癌的发生、发展及抗药性等中意义深远。此外，体内外实验表明，circ-DB通过抑制miR-34a和激活与去氢泛素相关的USP7/CyclinA2信号通路促进肝癌生长并减少DNA损伤，敲除circ-DB可逆转脂肪外泌体对肝癌细胞的影响，提示circ-DB有望成为高效的非侵入性早期肝癌的诊断指标[16]。综上所述，对此类失调的环状RNA的探索，有助于揭示肝癌发展和化疗耐药规律，为提高肝癌诊治率和预后奠定基础。

(2)环状RNA与胃癌:研究显示环状RNA在胃癌组织及体液中普遍下调。如Shao等[17]研究发现，hsa-circ-0014717在胃癌组织中下调且能稳定存在于人胃液中，其表达水平与肿瘤分期、远处转移、CA19-9的表达等显著相关，但其在健康组、胃溃疡和胃癌组之间无明显差异表达，仅在慢性萎缩性胃炎组显著降低，然而慢性萎缩性胃炎被认为是胃癌的高危因素之一，提示hsa-circ-0014717有望成为早期胃癌高危人群的筛选指标。此外该研究发现，在健康胃黏膜、胃炎、肠化生到胃癌发生4个阶段中，hsa-circ-0065149仅在胃癌阶段表达明显下调，而在其他3个阶段中含量无差异，且其在胃癌组织中的低表达与肿瘤直径、神经周围浸润以及高总生存期显著相关[18]。此外他们发现hsa-circ-0065149在早期胃癌患者血浆外泌体中同样显著下调，且较传统临床生物学标志物敏感度和特异性更高。提示hsa-circ-0065149作为胃癌新型的无创检测标志物，联合其他生化指标将显著提高胃癌检出率。然而Huang等[19]研究发现上调的circAKT3参与胃癌顺铂耐药的形成。

(3)环状RNA与结直肠癌：结直肠癌是世界范围内最常见的癌症之一，其发生率及病死率均较高，越来越多的研究报道了环状RNA推动了结直肠癌进展。研究发现，在大肠癌血浆和细胞系中显著上调的hsa-circ-0082182和hsa-circ-0000370与淋巴结转移密切相关，下调的hsa-circ-0035445与TNM分期密切相关[20]。但均与年龄等临床特征无关。且hsa-circ-0082182和hsa-circ-0035445在大肠癌术前和术后血浆中表达有显著性差异，而hsa-circ-0000370在这两个阶段差异无统计学意义。这3个circRNAs联合较单个用于鉴别诊断具有更高的精准度，提示这3个环状RNAs在大肠癌早期无创诊断中潜在的价值。此外Abu等[21]推测表达上调且在细胞外小泡中存在的hsa-circ-32883可能是化疗敏感的分子指标。

3.环状RNA与内分泌系统肿瘤

环状RNA与甲状腺癌：甲状腺癌是内分泌系统中最常见的恶性肿瘤，其发生率逐年升高。最近研究发现环状RNA在甲状腺乳头状癌(papillary thyroid cancer，PTC)的发生、发展以及耐药性中扮演重要角色。Minnan等[22]首次揭示了过表达circ-ITCH通过与miR-22-3p靶向结合上调b-连环蛋白E3连接酶CBL的表达抑制Wnt/β-catenin通路的激活，从而抑制PTC的进展。然而Ren等[23]研究发现，在甲状腺组织中hsa-circ-047771的低表达与BRAFV600突变、淋巴结转移及TNM分期有关，其高表达与TNM分期显著相关。提示这些失调的circRNAs在PTC的发病机制中起着重要作用。此外，近年来研究发现，上调的circEIF6参与甲状腺癌顺铂耐药性的形成，提示circEIF6可能作为反转甲状腺乳头状癌化疗耐药的分子靶点[24]。

4.环状RNA与生殖系统肿瘤

环状RNA与宫颈癌:Xu等[25]研究发现,hsa-circ-0109046和hsa-circ-0002577在子宫内膜癌患者的血清外泌体中显著高表达，提示其潜在的宫颈癌无创检测价值。然而体内外实验均证实circ-ITCH在宫颈癌组织及细胞中低表达，上调circ-ITCH可通过circ-ITCH/miR-93-5p/FOXK轴发挥抑癌作用，可见这些差异性表达的环状RNA在宫颈癌诊疗中具有潜在价值[26]。

5.环状RNA与其他肿瘤

研究表明hsa-circ-0000885在骨肉瘤组织及血清中明显上调，且其高表达与骨肉瘤不良预后相关[27]。此外在中晚期骨肉瘤及骨肉瘤肺转移患者血清中同样发现hsa-circ-0000885高表达，而在骨肉瘤化疗或手术后hsa-circ-0000885显著下调。可见其有望成为骨肉瘤诊断、治疗效果及不良预后监测的良好的生物学标志物。此外朱昆鹏等[28]研究发现，hsa-circ-0004674在化疗耐药的骨肉瘤细胞系和组织中明显上调，且其表达水平与骨肉瘤患者不良预后有关，提示hsa-circ-0004674作为骨肉瘤化疗耐药检测指标。

近年来研究发现，在鼻咽癌患者患者血清中circMAN1A2高表达，此外在口腔癌、甲状腺癌、卵巢癌以及肺癌患者中同样发现circMAN1A2显著高表达，进一步评价其临床特征，发现在上述5种肿瘤中circMAN1A2均表现出较高的诊断价值，其中在鼻咽癌中诊断价值最高[29]。总之，血清中circMAN1A2的检测将成为新型无创的恶性肿瘤的筛查指标。

四、展 望

综上所述，环状RNA具有多种生物学特性及功能，广泛存在于生物体内，在外泌体、血浆等非组织中表达失调，显示出其无创、高效的早期诊断以及动态监测肿瘤变化等方面潜在的价值。对于部分具有相同miRNA结合位点的环状RNA而言，他们在功能上是否存在协同或抑制尚不清楚，研究清楚这一点将对肿瘤多靶点协同调控具有重要参考意义。此外大多数肿瘤标本未分期或分级；样本量及检测技术局限；缺乏对差异表达的circRNA的动态检测以及对肿瘤患者长期追踪，这些均可影响检测结果。对以上问题的解决将使人们更全面地认识circRNA这一新兴分子，为其今后的临床应用打下坚实的基础。