探究lncRNAsASAP1-IT1在胆管癌（CCA）细胞增值及迁移中的作用

王景双，刘宏伟，于晓梅，曲义坤（通讯作者）

（1.佳木斯大学研究生院，黑龙江 佳木斯 154002；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154002）

0 引言

CCA威胁着全世界人民的健康和幸福。CCA是最常见的原发性肝恶性肿瘤之一。根据肿瘤的不同位置，可分为肝内胆管癌和肝外胆管癌。目前CCA的主要治疗方法仍然局限于治疗性手术和肝移植。尽管手术和化疗对该疾病的治疗取得了很大进展，但CCA患者的预后仍不理想[1]。因此，有必要为CCA寻找更多的治疗目标。

长于200nt的长链非编码RNA（lncRNAs）作为细胞转录的关键调节剂。据报道lncRNAs在人类癌症中可以作为肿瘤抑制剂或促进剂[2-3]。lncRNAs在癌细胞中最显著的功能是调节基因表达。且调控不良的lncRNA会影响疾病的进程。本研究假设调控不当的ASPA1-IT1阻碍CCA细胞的增值和迁移，目前lncRNA-ASPA1-IT1在CCA中的作用和机制尚不清楚。但在CCA组织和细胞中已发现ASAP1-IT1失调。ASAP1-IT1的高表达可预测CCA患者的不良预后。本研究在两组CCA细胞中进行功能丧失分析，以证明ASAP1-IT1在CCA细胞中的特殊功能。探讨ASAP1-IT1在CCA细胞中的增值和迁移的作用。根据实验结果，得出结论：沉默的ASAP1-IT1抑制细胞迁移和EMT进展。

1 实验材料与方法

1.1 组织样本。本研究收集了68对人体CCA组织及其邻近的正常组织，对临床确诊为CCA的患者进行了分析。（佳木斯大学第一附属医院，普外科。研究前，从每个病人得到伦理同意。本研究已获得了道德委员会第一事务所批准。）

1.2 细胞培养和转染。本研究使用的细胞株购自美国培养并保存。包括一个正常细胞株（kmbc）和五个CCA细胞株（huh-28、qbc939、hucct1、cclp1、rbe）。将CCA细 胞保存在DMEM培养基中，混合10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/mL链霉素。细胞培养在37℃的潮湿空气中，5%的二氧化碳。为了降低CCA细胞中ASAP1-IT1的表达水平，我们从Santa Cruz Biotechnology Inc.（美国德克萨斯州达拉斯市）获得了特定的shRNAs和nc shRNA。所有输血均使用Lipofectamine®2000进行。

1.3 RNA提取及QRT-PCR分析。根据说明，Trizol试剂（Invitrogen，CA，USA）用Nanodrop 2000（Wilmington，de，USA）测定RNA质量。琼脂糖凝胶电泳法检测RNA的完整性，然后用高容量cDNA反转录试剂盒（应用生物系统，福斯特城，CA，美国）反向转录总RNA（1μg）。所有反应均是在Bio-Rad CFX96实时PCR系统上进行，采用Taqman分析法（Bio-Rad，美国加利福尼亚州福斯特市）。 GAPDH作为内部参考。用2-ΔΔCt方法计算基因的表达水平，并归一化到对照组。

1.4 细胞增殖测定。MTT法有效地测定细胞的存活率。细胞（5000/孔），将细胞接种在96孔平板中24小时。根据需要将细胞转染后，保存在正常培养基中。在不同的时间点（0、24、48、72和96 h）将每个孔加入MTT溶液（5 mg/ml，20μl），培养4 h后从培养基中取出，加入100μl DMSO，测量560 nm下细胞溶解物的光密度（OD），评估存活细胞的相对数量。为了进行菌落形成分析，细胞被放置在6个孔板上。每孔3000个细胞的密度。然后在DMEM中培养。（含10%FBS）37℃。两周后，用PBS洗涤细胞并用甲醇固定0.5小时。用1%结晶紫染色固定点后，手工计算菌落数。

1.5 细胞迁移分析。采用跨井法测定细胞迁移能力。转染48小时后，从无血清细胞中取出细胞（5×104）。介质进入插入物的上腔（8μm孔径；微孔），同时向下腔中加入介质（含10%FBS）。培养24小时后，细胞停留在上膜上用棉绒去除。然而，迁移到下膜的细胞用甲醇和0.1%结晶紫染色。移植细胞用IX71倒置显微镜（日本东京奥林巴斯）成像计算。

1.6 蛋白质印迹分析。转染2天后，用胰蛋白酶（Beyotime，中国北京）消化CCA细胞。经添加蛋白酶抑制剂的Ripa-Lysis bu-ffer（Beyotime，中国北京）裂解，SDS-PAGE垂直电泳分离等量提取蛋白。接下来，将蛋白质转移到0.45μm的pvdf膜上（美国新泽西州皮斯卡塔韦，GE Healthcare）。然后，用5%脱脂牛奶堵塞膜，并在室温下用三步盐水（含0.05%吐温-20）稀释1.5小时。接下来，将膜与主要抗体（E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、SMO和GLI1）（美国ABCAM）混合培养12小时。经洗涤后，用二级抗体进行培育，最后用Beyoecl Plus试剂盒（北京贝奥蒂）进行印迹成像。

1.7 统计学分析。所有数据均以平均值±标准差的形式显示。依赖性分析。使用prism5（graphpad，美国）软件进行统计分析。采用学生t检验或单因素方差分析分析组间差异。用Kaplan-Meier法（对数检验）生成生存曲线。通过多变量生存分析，建立Cox比例风险模型，以确定与CCA患者总生存率相关的临床病理因素。只有当P＜0.05时，数据才被认为具有统计学意义。

2 主要结果

2.1 失调的ASAP1-IT1是CCA患者的预后因素。为了解ASAP1-IT1在CCA中的基本作用，进行QRT-PCR分析，以检测不同组织和细胞株中ASAP1-IT1的表达水平。首先，在CCA组织及其邻近正常组织中分别检测ASAP1-IT1的表达（图1a）。可见在CCA组织中ASAP1-IT1的表达明显高于正常组织。同样，在一个正常细胞株和五个CCA细胞株中分别检测ASAP1-IT1的表达水平进行对比（图1b）。可见在CCA细胞中ASAP1-IT1的表达高于正常细胞。其中在CCLP1和RBE细胞中表达水平最高。故选择这两个细胞株进行下一步分析。检测所有癌组织中ASAP1 -IT1表达水平后，计算平均值。作为阈值，将样品分为两组：ASAP1-IT1高表达组（n=37）和低表达组（n=31）。分析ASAP1-IT1表达与CCA患者临床病理特征的相关性。结果表明，ASAP1-IT1表达水平与肿瘤坏死、术后复发、淋巴结转移有关，与年龄、性别等因素无关（表1）。比例危险性分析证实ASAP1-IT1高水平表达是CCA患者的预后因素（P=0.028＊，表2）。Kaplan-Meier方法证实高表达ASAP1-IT1的CCA患者总生存率低于低表达组（图1c）。

图1 对CCA患者的预后影响因素是调节不良的ASAP1-IT1

表1 CCA患者ASAP1-IT1表达与临床病理特征的关系(n=68)

2.2 ASAP1-IT1基因敲除抑制CCA细胞增殖.根据上述结果，确定ASAP1-IT1在CCA中的预后价值。但需进一步确定在CCA中的生物学功能。为了解ASAP1-IT1对CCA细胞增殖的影响，使用特定shRNA干扰CCA细胞中ASAP1-IT1的表达（图2a）。在ASAP1-IT1下调的CCA细胞中进行MTT和集落形成分析。MTT分析表明，Sh-ASAP1-IT1降低细胞活力（图2b）。集落形成分析表明，ASAP1-IT1的敲除降低CCA细胞的集落数（图2c）。证实ASAP1-IT1对CCA细胞增殖有一定的影响。

2.3 沉默ASAP1-IT1对细胞迁移和EMT进展的影响。为进一步研究沉默的ASAP1-IT1对CCA细胞迁移和EMT形成的影响，在两组CCA细胞中进行了transwell分析和Westernblot分 析。 可 见， 与SHNC组 相 比，SH-ASAP1-IT1组CCA细胞的迁移能力受到抑制（图3a）。Westernblot分析表明，SH-ASAP1-IT1可显著提高上皮标记物的蛋白质水平，而沉默的ASAP1-IT1则可降低间充质标记物的蛋白质水平（图3b）。结论：沉默的ASAP1-IT1抑制细胞迁移和EMT进展。

表2 CCA患者预后参数的cox回归多变量分析

图2 ASAP1-IT1的减少阻碍了CCA细胞增殖。

图3 沉默ASAP1-IT1对细胞迁移和EMT干扰的影响。

3 讨论

在过去几十年中，许多lncRNA在恶性肿瘤中ASAPIT1被发现失调。并证明了lncRNAs在肿瘤发展中的调节作用[4-5]。本研究将ASAP1-IT1作为一种新的CCA调节因子。采用生物信息学分析方法，分析ASAP1-IT1对CCA的预后。ASAP1-IT1的高表达水平与CCA患者的总生存率呈负相关。针对ASAP1-IT1高表达，在CCA细胞中进行功能丧失分析。结果如预期，抑制ASAP1-IT1的表达对细胞增殖、转移和EMT进展有负作用。因此，确定了ASAP1-IT1在CCA进展中的作用。虽然本研究仅发现ASAP1-IT1在CCA进展中的作用，但研究结果仍有助于开发新的CCA治疗途径。我们将在未来寻找更多的ASAP1-IT1上游机制。