β-catenin调控NF-κB通路对大鼠前腭缝牵张成骨的作用

乔义强，李亚芳，王 早，胡瑞巧

上颌快速扩弓(rapid maxillary expansion，RME)是指对腭中缝施加机械牵张力以扩宽牙弓，常用于治疗上颌骨横向发育不足[1]。骨缝的机械性扩张常伴随不同程度的复发，其中一个重要的复发原因就是腭中缝尚未形成足够的新生骨质[2]。目前防止复发的有效方法之一是长时间保持[3],但这就延长了患者的治疗周期，所以如果能通过某种途径促进成骨，就会减少骨缝扩大后的复发。核转录因子NF-κB在骨改建的过程中发挥了非常重要的作用[4]；Wnt/β-catenin信号通路在生物生命活动中的作用，得到越来越多的关注，然而目前研究对骨代谢的调控作用，多集中于NF-κB或Wnt/β-catenin信号通路里的一种；有研究表明人类腭中缝牵张成骨中成骨方式，与大鼠前腭缝前部相似，且腭中缝前部矿化时间多于后部[5]。因此，该实验在两个信号通路研究的基础上，提出了NF-κB与Wnt/β-catenin通道交叉调控大鼠前腭缝牵张成骨，通过建立大鼠前腭缝牵张模型，初步探讨两个通路交叉调控大鼠前腭缝牵张成骨的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组选用45只健康雄性SPF级SD大鼠，8周龄，体质量(280±20) g[购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号SCXK(鲁)20140007]，在标准温度和湿度的条件下喂养，大鼠自由进食和饮水。将大鼠分为对照组、扩弓组、SB组，每组15只。

1.2 建立大鼠前腭缝扩张模型扩弓组、SB组大鼠10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔麻醉后，上颌中切牙装扩大簧，用0.016英寸澳丝弯制扩大簧，力量在(200±10)g，装扩大簧后SB组大鼠在前腭缝注射β-catenin激动剂SB-415286(美国Sigma公司)，1 mg/kg/d，将其稀释于DMSO中，对照组、扩弓组大鼠注射等剂量的赋形剂DMSO。3组大鼠分别于扩弓1、4、7 d后，腹腔注射过量水合氯醛处死，每次每组处死5只。

1.3 标本的处理与染色大鼠处死后即刻取标本。10%福尔马林固定，次日使用高分辨率Micro-CT (SKYSCAN1272，比利时Bruker公司)进行扫描。 EDTA脱钙后石蜡包埋切片，进行HE、Masson染色观察前腭缝组织形态学改变，IHC染色观察相关因子的变化并用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对成骨因子的表达量进行IOD分析。

1.4 统计学处理应用SPSS 21.0软件包，进行正态性及方差齐性检验后，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计处理。检验水准为α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验期间大鼠的体质量变化情况实验期间，扩弓组、SB组大鼠对扩大簧耐受良好，3 组大鼠均未出现黏膜感染、死亡等意外情况，符合本实验的要求。对照组大鼠平均体质量随天数增加而稳步增加，扩弓组、SB组大鼠平均体质量在扩弓第1、2天下降，第3天后开始恢复增长(图1)。扩弓组、SB组大鼠的平均体质量均小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，而扩弓组与SB组大鼠之间平均体质量的差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 实验期间大鼠的体质量变化情况

2.2 Micro-CT 影像下大鼠前腭缝宽度的变化图2中观察到对照组大鼠前腭缝形态无明显改变，扩弓组、SB组大鼠第4天开始前腭缝宽度明显增加，并且在骨缝中央可见小的指状突起，到第7天前腭缝宽度进一步增加，指状突起数量与长度都明显增加。表1比较了3组大鼠实验期间前腭缝宽度的变化，与对照组相比，扩弓组、SB组在各个时间点前腭缝宽度均增加，差异有统计学意义(P<0.05)，然而，扩弓组、SB组之间宽度的差异无统计学意义(P>0.05)。

图2 实验期间3组大鼠上颌前腭缝Micro-CT影像

2.3 大鼠前腭缝组织学改变对照组大鼠的前腭缝主要由腭骨边缘覆盖的软骨细胞层及中间的纤维组织构成，成骨细胞沿着骨缝两侧稀疏排列。 扩弓组、SB组大鼠第4天可观察到前腭缝变宽，边缘有新生类骨质生成，呈指状突起，体积较大的成骨细胞呈层叠状排列，覆盖在新生类骨质上。加力7 d后，新骨形成明显呈指状，两侧部分长的指状新骨交叉重叠，骨边缘及类骨质中的成骨细胞也明显增多(图3A)，缝中间的胶原纤维沿着扩张力的方向平行排列(图3B)。

2.4 免疫组化结果

2.4.1NF-κB p65与β-catenin表达情况 NF-κB p65与β-catenin在对照组中很少表达，在扩弓组、SB组大鼠沿着前腭缝积聚的成骨细胞中，可观察到强烈的NF-κB p65与β-catenin表达。 扩弓组、SB组NF-κB表达明显强于对照组，SB组NF-κB表达相对弱于扩弓组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05, 图4A)；与扩弓组相比，SB组前腭缝中β-catenin的表达明显增多,差异有统计学意义(P<0.05, 图4B)。

表1 实验期间3组大鼠上颌前腭缝宽度的变化(μm)

与同时间点对照组比较：*P<0.05

图3 3组大鼠不同天数上颌前腭缝 ×20A：HE染色 ；B：Masson染色

2.4.2BMP-2的表达情况 光镜下观察对照组大鼠前腭缝，少量成骨细胞沿上颌骨边缘不连续分布。扩弓组、SB组大鼠前腭缝中BMP-2阳性成骨细胞呈梭形，并连续覆盖新形成的指状突起表面(图5A)。与对照组大鼠相比，扩弓组、SB组大鼠切片中BMP-2的IOD值从第1天开始显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。当比较扩弓组、SB组大鼠时，发现SB组大鼠上颌前腭缝组织中BMP-2的IOD值比扩弓组大鼠的高，差异有统计学意义(P<0.05，图6A)。

2.4.3OCN的表达情况 光镜下观察OCN免疫组化染色结果与BMP-2呈类似趋势，且更加明显。对照组大鼠上颌前腭缝无明显OCN阳性细胞，而扩弓组、SB组大鼠上颌前腭缝区域OCN阳性细胞明显增多，第7天，SB组大鼠可看到棕色颗粒大量层叠状出现在上颌骨前腭缝及指状突起表面(图5B)。扩弓组、SB组大鼠上颌前腭缝组织中OCN的IOD值在扩弓4、7 d后显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与扩弓组大鼠相比，SB组大鼠上颌前腭缝组织中OCN的IOD值比扩弓组高，差异有统计学意义(P<0.05，图6B)。

图4 3组大鼠 NF-κB p65、β-catenin免疫组化染色的IOD值

A：NF-κB p65；B：β-catenin；与对照组相比：*P<0.05，**P<0.01；与扩弓组相比：#P<0.05，##P<0.01

图5 3组大鼠上颌前腭缝BMP-2、OCN免疫组织化学染色 ×20A：BMP-2；B：OCN

图6 3组大鼠BMP-2、OCN免疫组化染色的IOD值

A：BMP-2；B：OCN；与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与扩弓组比较：#P<0.05

3 讨论

从儿童、青少年到年轻成人，上颌扩弓可有效地解决上颌骨横向不足的问题[6]，本实验通过对年轻成年SD大鼠的扩弓实验发现，扩大簧可以成功扩开大鼠上颌骨前腭缝，通过对Micro-CT和HE组织学观察发现前腭缝增宽，新骨在前腭缝成指状结构，随着时间的延长，新形成的指状骨是薄而长，这一发现提醒我们在进行上颌横向扩张的过程中，特别是在扩张早期，要注意力的大小，若力过大，可能影响成骨作用导致骨吸收。

有实验表明，机械力刺激能够促进成骨细胞增殖分化，激活细胞中多种相关基因的转录，促进新骨形成[7]。本实验中扩弓组、SB组大鼠前腭缝及新生骨表面呈层叠状排列着大量成骨细胞，边缘新生骨基质形成，显示出活跃的成骨活动，前腭缝结缔组织内还可见大量的成纤维细胞，胶原纤维沿着扩张力的方向排列。这与先前的研究结果相一致。

Wnt信号通路可对成骨细胞和破骨细胞的成熟、分化和凋亡过程进行调控，进而维持机体骨代谢平衡[8]。β-catenin是Wnt信号通路的关键下游成分，国内学者发现，大鼠前腭缝受牵张力作用时，成骨细胞β-catenin表达增加，新骨形成增多[9]。实验中扩弓组、SB组大鼠前腭缝中β-catenin呈强阳性在成骨细胞中表达。这些结果与先前的报道一致，表明机械力可激活大鼠上颌骨前腭缝成骨细胞中Wnt/β-catenin通路，增加β-catenin表达。本实验使用β-catenin激动剂SB-415286，抑制了β-catenin的降解，SB组大鼠β-catenin在前腭缝周围及新骨内表达更加显著。

有学者在验证机械张力通过NF-κB途径对成骨作用的影响时，发现机械张力能够促进成骨细胞中NF-κB的表达、核易位以及与DNA结合活性[10]。在机械力作用下，成骨细胞NF-κB通路被激活，增加了关键成骨转录因子Runx 2的表达[11]。本实验扩弓组、SB组大鼠在前腭缝周围以及新骨内积聚的成骨细胞中，可观察到强烈的p65表达，表明NF-κB通路被激活，验证了先前的研究，证明了机械张力可激活大鼠前腭缝成骨细胞中NF-κB通路。而SB组NF-κB p65表达相对弱于扩弓组大鼠，表明使用β-catenin激动剂抑制了NF-κB活性。

BMP-2参与牙齿移动、上颌扩弓等矫治过程中的骨代谢和骨改建[12]，有研究发现，在正畸过程中，BMP-2形成增多，并参与其中的骨吸收、骨形成[13]。本实验中，扩弓组大鼠上颌前腭缝BMP-2的IOD值较对照组显著增大(P<0.05)，证明了机械扩张力可以促进大鼠前腭缝BMP-2的表达。OCN是另一个重要的成骨因子,多存在于成骨细胞及其分泌的骨基质中，既是成骨细胞分化、成熟的标志，也是骨形成的重要标志，主要存在于成骨细胞及其分泌的骨基质当中。在此次实验中，我们发现与对照组相比， 扩弓组、SB组大鼠的OCN表达量在第4、7天均升高。在注射β-catenin激动剂后，NF-κB活性受到抑制，SB组大鼠BMP-2、OCN的表达量明显高于扩弓组和对照组，与Chang et al的研究一致，抑制NF-κB活性可以促进成骨细胞的成骨作用[11]。

综上，机械牵张力可激活SD大鼠前腭缝组织中NF-κB与Wnt/β-catenin通路，促进骨改建活动。使用β-catenin激动剂进一步激活Wnt/β-catenin通路，下调了NF-κB p65，抑制了NF-κB活性，成骨因子BMP-2、OCN表达增多，加速了上颌骨前腭缝新骨的形成与钙化沉积，将有利于缩短RME疗程，有利于降低矫治后复发率，对临床具有一定的指导意义。