尾巨桉M8无性系增殖培养技术研究＊

林 桦 邓海燕 曾 奇 莫晓勇

（1.中林集团雷州林业局有限公司，广东 湛江 524043；2.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642）

植物组织培养是目前植物无性繁殖最有效的方式，通过组织培养可以保持良种的优良性状。优树幼化的器官基因型相同，遗传性状也相同，通过快速繁殖，可成为遗传稳定且数量巨大的无性系群体，当前人工用材林苗木大部分来自于此[1]。在中国，桉树已经支撑起了一个完整的产业链，包括制浆造纸产业和人造板产业。利用植物组织培养技术进行桉树离体快繁，既有利于保持良种的优良性状又能满足当前营造速生林的种苗需求，具有良好的经济效益和发展前景[2]。本实验将通过对已经进行过无性系测定的M8 桉树无性系进行研究，采用组培丛芽发生途径，对接入外植体建立无菌系、诱导丛芽、增殖培养不同培养阶段的培养基成分和培养条件进行优化筛选，以获得较优的组培配方，期望为其组培扩繁技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 外植体获取

在尾巨桉（Eucalyptus urophylla×E.grandis）M8（以下简称M8）大树离基部20 cm 的地方，往上环割一圈8～ 10 cm 的切口，环割1～ 2 个月后对要采集的枝条提前3～ 5 d 进行遮光预处理，亦可提前3 天喷洒抗菌药品等，采集萌条时间为3至4 月份。在天气晴朗的上午11:00 时左右，从试验母本上剪取带芽茎段萌条作为外植体，去掉大部分叶片，注意保鲜，避免失水。

1.2 外植体消毒

将采回的枝条先用含有0.02%（适当滴入几滴即可）的洗洁精溶液浸泡10 min，用棉花轻轻擦洗表面，清水冲洗2～ 3 h。然后去掉全部叶片，按叶芽将茎修剪成2～ 3 cm 的小段，叶芽处于中间位置，修剪好后根据枝条幼嫩程度分组，放入灭菌三角瓶里密封带入试验室。在操作台上先用无菌水冲洗1～ 2 次，再进行消毒处理。消毒方法：如果枝条比较老，则需要先用75%酒精浸泡30 s 后，用无菌水冲洗1 次再用升汞消毒；如枝条较嫩则可只用升汞消毒。本次枝条消毒采用的是升汞二次消毒法：先用0.1%的升汞溶液浸泡茎段1～ 3 min，并轻晃三角瓶，接着用无菌水快速冲洗5～ 7 次，无菌水的第1 次冲洗一定要迅速，避免升汞残留浓度影响，第2 次以后冲洗晃动三角瓶应大于1 min；冲洗完将茎段放入盘中进行切割，将小段上下末端分别切去0.5 cm 左右，再用0.1%升汞消毒1 min，最后再用无菌水快速冲洗5～7次。消毒完毕后将茎段接入MS+6-BA 0.2 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L，pH 为5.8 的培养基中，每瓶培养基接入1 个茎段。接种后每天进行观察记录，统计污染率及诱导率。

1.3 增殖培养

设置不同基本培养基、不同浓度的 6-BA、不同浓度的 IBA、不同浓度蔗糖和不同pH 值的试验处理，将萌发长至1 cm 左右的腋芽切下，接种到不同处理的增殖培养基上。每个处理接种5 瓶，每瓶8 个芽，均重复3 次。置于光照强度1 500～2 000 lx、光照时间12 h/d、温度为25 ℃的条件下进行培养。接种20 d 后统计相关数据及苗生长状况。

1.3.1 不同基本培养基的配制 由于本实验的基本培养基MS 的效果已经较好，故筛选最佳培养基只在MS 培养基内筛选，采用以下5 种含量的MS 培养基进行试验（表1）。每个处理中的其他添加物均为6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L。

表1 不同基本培养基的增殖试验Table 1 Multiplication tests of different minimal medium

1.3.2 不同浓度的6-BA 或IBA 的设置 每处理的基本培养基均为改良MS（表2）。对于不同浓度的 6-BA 的增殖试验，其他添加物为 IBA 0.1 mg/L+蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L。对于不同浓度的IBA 的增殖试验，其他添加物为 6-BA 0.2 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L。

表2 不同浓度的 6-BA 的增殖试验Table 2 Multiplication tests of 6-BA at different concentrations

1.3.3 不同蔗糖浓度、不同pH 值的设置 植物组织培养过程中，不同的碳源浓度、培养基的酸碱度、凝固剂用量和光照强度均会对继代增殖产生影响。本试验探索了蔗糖浓度、培养基的pH 值对M8的增殖效果的影响（表3）。每处理的基本培养基均为改良MS，其他添加物为6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L+卡拉胶 6.8 g/L。

表3 不同蔗糖浓度和pH 值的增殖试验Table 3 Multiplication tests of different sucrose concentrations and pH values

1.4 数据统计与分析

试验中所有数据采用WPS 2013 和SPSS 19.0软件进行统计分析和作图。

诱导率 (%)=(诱导出腋芽的外植体数/接种总数)×100

污染率 (%)=(污染总数/接种总数)×100

发芽率 (%)=(发芽总数/接种总数)×100

增殖系数=总芽数/接种芽数

有效芽数：芽长 ≥ 1.2 cm 的芽数

2 结果与分析

2.1 无性系M8 无菌系的建立

接种于MS+6-BA 0.2 mg/L 培养基中的外植体，在接种后的第5～7 天叶柄基部开始出现白色圆环状裂痕，叶柄开始脱落；部分腋芽开始萌动，15～ 20 d 后腋芽长至1 cm 左右，由此可见，该培养基适于M8 外植体腋芽的诱导。平均污染率为15.3%，平均诱导率为77.9%。

2.2 增殖培养

2.2.1 不同基本培养基对M8 无菌芽增殖效果的影响 从表4 可知，不同含量的MS 培养基对增殖系数和有效芽数的影响较大。培养至20 d 时，苗高由高到低排序为EM5(改良MS)＞ EM4(2MS)＞EM3(MS)＞ EM2(3/4MS)＞ EM1(1/2MS)，其 中 每瓶苗高均值的极大值2.95 cm 出现在EM5 中，极小值为EM1 的1.65 cm。不同处理的每瓶有效芽数从大到小顺序为EM5 ＞ EM3 ＞ EM4 ＞ EM2 ＞EM1；其中每瓶有效芽数的极大值为41，出现在EM5 中，极小值为15 出现在EM1 中。增殖系数上不同处理由大到小顺序为EM3 ＞ EM5 ＞ EM2 ＞EM4 ＞ EM1；其中每瓶增殖系数极大值为4.7，出现EM3 中，极小值1.8 出现在EM1 中。

方差分析可知，不同含量的MS 培养基处理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的F值分别为5.302、22.205 和60.996，均为P＜ 0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在极显著差异。由多重比较结果可得，EM5处理的苗高与EM1 处理的苗高有显著差异，余下3 个处理间无显著差异；EM5、EM3 与EM4、EM2、EM1 在每瓶有效芽数上有显著差异；EM3、EM5 与EM2、EM4、EM1 在增殖系数上有显著差异。结合苗的生长情况来看（表4），随着培养基母液含量的增加，苗的整体生长情况的指标值是呈现先升高后降低的趋势，当培养基母液含量为一倍MS(EM3)时生长情况最好。同时，EM3 和EM5 处理的整体表现相当，尤其在增殖阶段的增殖系数和有效芽数都很高，但是EM3 会出现苗上长愈伤的情况，而改良后的MS 培养基EM5 则没有出现长愈伤的情况，所以EM5(改良MS)是M8增殖阶段的最佳培养基。

表4 不同基本培养基对增殖效果的影响Table 4 Effects of different minimal medium on multiplication

2.2.2 不同浓度的 6-BA 对M8 无菌芽增殖效果的影响 从表5 可知，当IBA 固定为0.1 mg/L 时，不同含量的6-BA 对增殖系数和有效芽数的影响较大。接种20 d 时，苗高由高到低排序为A2 ＞ A3 ＞A1 ＞ A4 ＞ A5，其中每瓶苗高均值的极大值2.95 cm 出现在A2 处理中，极小值1.32 cm 出现在A5处理中。不同处理的每瓶有效芽数从大到小顺序为A2 ＞ A3 ＞ A4 ＞ A5 ＞ A1；其中每瓶有效芽数的极大值为49，出现在A2 处理中，极小值为10，出现在A1 处理和A5 处理中。增殖系数上不同处理由大到小顺序为A2 ＞ A3 ＞ A4 ＞ A5 ＞ A1；其中每瓶增殖系数极大值为5.2，出现在A2 中，极小值为1.2，出现在A1 和A5 中。

表5 不同浓度6-BA 对增殖效果的影响Table 5 Effects of different concentrations of 6-BA on multiplication

6-BA 对增殖系数和有效芽数的影响较大。在6-BA 的浓度为0 的处理A1 中，其增殖系数和有效芽数都很少，腋芽萌发量少，苗矮小且长势不好，少量苗有根长出；在6-BA 浓度为1～ 2 mg/L的处理A4、A5 中，随着6-BA 浓度的升高，苗的有效芽越少、产生的愈伤越多、苗长势越差、叶色发黄；在6-BA 浓度由0 增加到0.2～ 0.5 mg/L(A2、A3)时，M8 的有效芽数和增殖系数都提高了1～ 2 倍，叶色翠绿且舒展，苗的长势也很好。

方差分析可知，不同浓度的6-BA 处理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的F值分别为20.235、72.441 和138.196，均有P＜ 0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在极显著差异。由多重比较结果可知，A2、A3 处理的苗高与A4、A5 处理的苗高有显著差异；A1 处理与A5 处理间每瓶有效芽数上无显著差异，与其他处理间均有显著差异；A1 处理与A5 处理间增殖系数上无显著差异，与其他处理间均有显著差异。综上所述，适宜M8 增殖的6-BA浓度为0.2～ 0.5 mg/L。

2.2.3 不同浓度的 IBA 对M8 无菌芽增殖效果的影响 从表6 可知，当6-BA 固定为0.2 mg/L 时，接种20 d 后，苗高由高到低排序为B4 ＞ B3 ＞ B5＞ B2 ＞B1，其中每瓶苗高均值的极大值2.95 cm出现在B4 处理中，极小值1.52 cm 出现在B1 处理中。不同处理的每瓶有效芽数从大到小顺序为B4 ＞ B5 ＞ B3 ＞ B2 ＞B1 ；其中每瓶有效芽数的极大值为37，出现在B4 处理中，极小值为11，出现在B2 处理中。增殖系数上不同处理由大到小顺序为B4 ＞ B5 ＞ B3 ＞ B2 ＞B1；其中每瓶增殖系数极大值为4.8，出现在B4 处理中，极小值为2.1，出现在B1 处理中。

当IBA 浓度为0 时(B1)，苗高增长率只有80%左右；当IBA 浓度位于0.01～ 0.1 mg/L 之间时(B2、B3、B4)，随着其浓度的升高，苗高、有效芽数和增殖系数都升高，苗的叶片翠绿，趋于舒展，愈伤减少，长势也由一般变为好；当IBA浓度为0.2 mg/L 且等于6-BA 浓度时(B5)，苗高降低，有效芽数和增殖系数依旧保持在良好水平，产生了少量的愈伤组织（表6）。

表6 不同浓度IBA 对增殖效果的影响Table 6 Effects of different concentrations of IBA on multiplication

方差分析可知，不同浓度的IBA 处理的每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的F值分别为18.378、36.679 和22.348，均有P ＜ 0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在极显著差异。由多重比较结果可知，B4 处理的苗高与余下4 个处理的苗高有显著差异；B4、B5 处理与B1、B2、B3 处理间每瓶有效芽数上有显著差异；B4 处理与B1 处理间增殖系数上有显著差异，B2、B3、B5 处理间无显著差异。综上所述，低浓度IBA 较适宜M8 增殖，浓度范围为0.05～ 0.2 mg/L，产生的叶翠绿、芽粗壮、愈伤少、长势好。

2.2.4 不同蔗糖浓度对M8 无菌芽增殖效果的影响 从表7 可知，接种20 d 后，苗高由高到低排序为S3 ＞ S4 ＞ S2 ＞ S5 ＞ S1，其中每瓶苗高均值的极大值2.92 cm 出现在S3 处理中，极小值1.65 cm出现在S1 处理中。不同处理的每瓶有效芽数从大到小顺序为S3 ＞ S4 ＞ S5 ＞ S1 ＞ S2；其中每瓶有效芽数的极大值为36，出现在S3 处理中，极小值为11，出现在S2 处理中。增殖系数上不同处理由大到小顺序为S3 ＞ S4 ＞ S2 ＞ S5 ＞ S1；其中每瓶增殖系数极大值为5.2 出现在S3 处理中，极小值为1.5出现在S5 处理中。在蔗糖浓度为10～ 30 g/L 的处理 S1、S2、S3 中，低浓度处理S1 中苗产生了玻璃化的现象、叶片出现畸形，长势很差，随着浓度的升高增殖系数和苗高也增加，苗的叶片叶色变深，趋于舒展，长势变好；当蔗糖浓度大于30g/L 时，随着其浓度的升高，苗高、有效芽数和增殖系数呈现降低趋势，苗的基部愈伤增多，影响苗对营养的吸收，叶片变黄脱落，长势变差。

表7 不同蔗糖浓度对增殖效果的影响Table 7 Effects of different concentrations of sucrose on multiplication

方差分析可知，不同蔗糖浓度的处理，其每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的F值分别为1.677、696.733 和13.638，均有P＜ 0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在极显著差异；S3 处理的苗高与余下4 个处理的苗高有极显著差异。每瓶有效芽数除S1、S5处理无显著差异外，其他均有极显著差异；S1 处理与S5 处理间增殖系数上无显著差异，S2、S3、S4 处理相互间有显著差异。综上所述，蔗糖浓度为30 g/L 的S3 处理最适宜M8 的增殖。

2.2.5 不同pH 值对M8 无菌芽增殖效果的影响从表8 可知，接种20 d 后，苗高由高到低排序为P3 ＞ P1=P2 ＞ P4 ＞ P5，其中每瓶苗高均值的极大值2.95 cm 出现在P3 处理中，极小值1.64 cm 出现在P5 处理中。不同处理的每瓶有效芽数从大到小顺序为P3 ＞ P2 ＞ P1 ＞ P5 ＞ P4 ；其中每瓶有效芽数的极大值为34，出现在P3 处理中，极小值为15，出现在P5 处理中。增殖系数上不同处理由大到小顺序为P3 ＞ P2 ＞ P1 ＞ P4 ＞ P5；其中每瓶增殖系数极大值为4.9，出现在P3 处理中，极小值为2.1，出现在P5 处理中。培养基的pH 值会影响培养基凝固的效果和软硬程度，当pH 值为5 时(P1)，培养基的很软，虽然增殖系数和有效芽数都不是很低，但是丛芽产生玻璃化的现象比较严重，叶片出现畸形，芽苗长势差质量差；当pH 值在5.4～ 6.4 的范围内时(P2、P3、P4)，其苗高、有效芽数和增殖系数呈现先上升后下降的趋势，在这一范围内M8 都能正常生长，叶片翠绿舒展，长势也好，表现最好的是P3 处理；当pH 值等于7 时(P5)，培养基很硬，苗生长质量有所下降，叶片变黄脱落，苗高和增殖系数都有所下降。

表8 不同pH 值对增殖效果的影响Table 8 Effects of different pH value on multiplication

分析可知，不同pH 值的处理，其每瓶苗高均值、每瓶有效芽数以及增殖系数的F值分别为25.191、55.542 和98.778，均有P＜ 0.01，表明不同处理间的苗高、有效芽数以及增殖系数均存在显著或极显著差异。其中，P3 处理的苗高、每瓶有效芽数、增殖系数上均和其他4 个处理的有极显著差异。P1、P2 和P5 处理间的苗高有极显著差异。P2 处理的每瓶有效芽数和增殖系数与其余处理有极显著差异。综上分析，最适宜M8 增殖的pH 范围为5.4～ 6.0。

3 结论与讨论

桉树是目前生长速度最快的人工林用材树种，不仅树干可取材，树叶还可以用于提取桉油，用途十分广泛，需求量十分巨大。本实验对于已经进行过无性系测定的优良品种尾巨桉M8 进行了组织培养研究，对其外植体芽诱导培养和无菌芽增殖培养进行了单因素影响因子的相关探索。

3.1 桉树植物组织培养无菌苗的获得有两种途径，一是通过诱导愈伤组织，再从愈伤组织分化出不定芽，这样耗时长且继代苗易发生变异；另一种途径是采集嫩枝进行腋芽诱导，再以芽繁芽，这样耗时较短且继代苗较稳定。本试验选择以芽繁芽方式，外植体消毒采用的是75%酒精加0.1%升汞二次消毒法，效果较好；诱导培养基为MS +6-BA 0.2 mg/L+蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L，pH为5.8，腋芽萌发很快，10～ 15 d 为出芽高峰期，平均诱导率为77.9%。

腋芽诱导阶段常常会发生污染以及褐化的问题[3-4]。外植体的预处理对污染率、褐化率影响较大，外植体带菌情况、引起褐变的物质因生长季节不同而有所差异[5]。对大树进行环割复幼可以得到生理年龄较小的枝条，采集枝条最好选择春季，因为春季的植物内生菌相对较少，可以适当降低污染率。徐南翔[6]对桉树离体培养的研究表明，3-5 月份采集的外植体比下半年采集的外植体污染更少，且褐化率更低。采条部位也很重要，枝条下部的木质化程度高，容易发生灭菌不充分或者灭菌过度死亡；枝条中上部则接种诱导成功率会高一些。采条之前提前一周对枝条进行遮光和杀菌处理，可以降低外植体携带微生物的几率。

3.2 培养基的激素种类和浓度配比是影响有效芽数和增殖系数的重要因子，基本培养基只能保证植物的最低生存需求和生理活动，除了选择合适的基本培养基和基本培养条件，植物的愈伤组织诱导、腋芽诱导、增殖继代和生根诱导最主要还是依赖激素的选择。试验分析了不同含量基本培养基的作用效果，筛选了不同种类及浓度配比的激素和蔗糖，得到结果如下：适宜M8 增殖的培养基为改良MS 培养基、6-BA 浓度为0.2～ 0.5 mg/L、IBA 浓度为0.05～ 0.2 mg/L，蔗糖浓度为 30 g/L、pH 值范围为5.4～ 6.0。最终确定了最优的继代增殖培养基为改良MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.1 mg/L +蔗糖 30 g/L+卡拉胶 6.8 g/L，并将pH 调至5.4～6.0，可以获得增殖系数为4.49 的增殖效果，且继代苗叶片舒展，生长健壮，提高了组培效率，发挥了组培快繁的优势。

在尾巨桉M8 的培养过程中出现了少量的玻璃化苗的情况。玻璃化苗的茎段和叶片呈现白色半透明状，水渍化、脆弱易断，增殖困难。玻璃化苗的实质是在高温高湿、高激素浓度的培养下，细胞分裂速度和体积增大速度过快，致使干物质积累速度跟不上细胞增大速度，植物细胞只能用水分来填充体积，从而表现出水渍化和玻璃化。玻璃化苗的含水量很高，苗很脆弱，生长势很差，基本无法成活，这也成为组培育苗的一大阻碍。本试验中使用低浓度的细胞分裂素，控制培养基的pH 在5.4～ 6.0 之间，有效减少了玻璃化苗的出现。另有少量苗顶长愈伤组织的情况，在对MS的进行改良后，采用改良MS 培养基进行继代增殖，愈伤得到了很好地控制。