一株食用菌绿霉病菌拮抗菌株的分离与鉴定*

杨 武，王 威，向世海，夏志兰，罗 坤，**

（1.湖南农业大学 植物保护学院，湖南 长沙410128；2.湖南农业大学 食用菌研究所，湖南 长沙410128）

木霉（Trichoderma） 又叫绿霉，是食用菌生产中普遍发生的一个竞争性杂菌，具有适应性强、繁殖速度快、为害期长的特性，可侵染灵芝(Ganoderma lucidum）、杏鲍菇（Pleurotu eryngii）、香菇（Lentinus edodes）、木耳（Auriculariaspp.） 等多种食用菌的栽培料、菌种和子实体，可造成减产甚至绝收，严重影响商业化生产[1-4]。目前，竞争性病害常见的处理措施有蒸汽灭菌、热水浸泡、接种室熏蒸消毒、及时清理废料和化学防治[5-6]。物理措施并不能避免病害的发生，因此主要采取的措施还是化学防治。然而，尽管化学防治在病害防治中占主导地位，但是一些杀菌剂如多菌灵，木霉已产生了较强的抗性，并且化学药剂的不合理使用会导致农药残留问题，影响食用菌品质，引发一系列安全问题[7-9]。因此，寻找一种新的安全高效的食用菌病害防治措施迫在眉睫[10]。生物防治具有对人畜无害、对环境友好和对病原菌特异性强等优点[11]，已成为近年来国内外的研究热点。笔者在调查湖南省木耳病害时，发现绿霉病发生严重的地块污染率达30%，有的地块甚至绝收。从湖南省麻阳县中采集回来的30 个发病面积较小的绿霉病害样品中，分离筛选了一株对木霉有较强抑制作用的菌株，经鉴定，该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并进行了抗菌谱试验，旨在发掘其抗菌广谱特性，为食用菌病害的防治提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

30 个木霉病害样品由湖南省麻阳县提供，其发病面积较小，供试病原真菌长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 为湖南农业大学食用菌研究所前期研究分离。食用菌（杏鲍菇、灵芝、大球盖菇、双胞蘑菇、姬松茸、秀珍菇及黑木耳） 菌种均由湖南农业大学食用菌研究所提供。用于抗菌谱试验的4 种食用菌病害真菌，蘑菇镰胞霉病菌（Fusarium equiseti）、平菇毛霉病菌（Lichtheimia corymbifera）、黑木耳青霉病菌（Penicillium paneum） 和黑木耳链孢霉病菌（Neurospora crassa） 为本课题组分离并保存。

1.1.2 供试培养基及试剂盒

供试细菌与真菌的培养分别采用LB 培养基、马铃薯琼脂葡萄糖（PDA） 培养基。生化鉴定所用试剂为细菌微量生化鉴定管，均由北京陆桥技术股份有限公司提供。Ezup 柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒和SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒均由生工生物工程（上海） 股份有限公司提供。

1.2 细菌的分离、纯化和保存

细菌的分离采用稀释分离[12]的方法，从菌袋的病键交界处取木屑5 g，将其与45 mL 无菌水混合，后置于振荡培养箱中充分振荡，10 min 后取出，即得到浓度为10-1的菌悬液。静置3 min，用移液枪吸取1 mL 上清液，加入到盛有9 mL 无菌水的试管中，充分摇匀，制成浓度为10-2的菌悬液，重复上述操作，分别制成浓度为10-3、10-4和10-5的菌悬液。在超净工作台下，用移液枪分别吸取10-5～10-2四个浓度的菌悬液各800 μL 于LB 固体培养基，用涂布棒涂布均匀，每个浓度设3 个重复，并设等量无菌水为对照（CK），30℃恒温培养1 d~2 d。将上述菌株分别进行纯化，后转入斜面培养基于4℃保存。

1.3 细菌对食用菌绿霉病病菌拮抗作用的测定

1.3.1 初筛

采用平板对峙法[13]，用打孔器取一新鲜的木霉菌饼（8 mm） 倒置于PDA 培养基中央，用接种环挑取纯化后的细菌于中央右侧1/2 处，并划一道竖直长线（接近培养皿边缘），每个细菌设3 个重复。将平板置于30℃培养箱中恒温培养3 d~4 d，观察记录木霉的生长情况，选出对木霉生长有较强抑制作用的菌株进入复筛。

1.3.2 复筛

采用管碟法[13]，将初筛过的具有拮抗作用的细菌，接种于LB 培养基中，培养24 h 后备用。将木霉菌株培养3 d 后，用无菌水洗下培养基表面的孢子，4 层纱布过滤后，制成孢子悬浮液。无菌操作下用移液枪吸取800 μL 木霉悬浮液于PDA 培养基中均匀涂布，静置10 min 后，取牛津杯（内径6 mm，外径8 mm） 于平板中央，取培养24 h 后的拮抗菌发酵液200 μL，用0.22 μL 的细菌过滤器过滤后，将滤液缓慢注入牛津杯中央，并设等量无菌水为对照，每个菌种设3 个重复，30℃培养3 d~4 d 后用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.4 拮抗菌分类鉴定

1.4.1 拮抗菌的形态特征和生理生化性状

参照《常见细菌系统鉴定手册》[14]和《伯杰细菌鉴定手册》[15]对效果最好的拮抗菌的形态特征与生理生化性状进行分析鉴定。

1.4.2 拮抗菌的分子生物学鉴定

1） 拮抗菌me-1 基因组DNA 的提取

采用上海生工生物工程有限公司Ezup 柱氏细菌基因组抽提试剂盒提取拮抗菌基因组DNA。

2） 拮抗菌me-1 的16S rDNA 的PCR 扩增回收与测序

以27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’为正向引物，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’为反向引物，菌株DNA 为模板，采用20 μL 反应体系进行DNA 的扩增，流程为94℃预变性4 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸10 min；4℃保温。采用1%琼脂糖电泳，150 V、100 mA、20 min 对PCR 扩增产物进行电泳观察。采用SanPrep 柱式DNA 胶回收试剂盒对纯化后的产物进行回收，并将其送至上海生工进行测序。

3） 测序与系统发育分析

将测序结果通过BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 进行分析，将BLAST 结果中相似菌株选取出来，用Mega 7 软件进行系统发育分析并构建系统发育树。

1.5 拮抗菌对不同食用菌的抑制作用

将拮抗效果最好的细菌（me-1） 分别与杏鲍菇、灵芝、双孢蘑菇、大球盖菇、姬松茸、黑木耳共6种食用菌进行平板对峙培养（操作方法同1.3.1），2 d、5 d、10 d 分别观察菌株me-1 对不同食用菌的抑制作用。

1.6 抗菌谱试验

以me-1 为指示菌，采用1.3.1 中的方法对4 种供试食用菌病原真菌进行初筛，采用菌丝生长速率法[14]对初筛后的真菌进行抑菌效果的测定。用0.22 μm 的细菌过滤器过滤30℃培养2 d 的me-1 的发酵液，取1 mL 发酵液过滤液原液于培养皿中，将10 mL 的PDA 培养基（55℃左右） 倒入皿中，充分混匀，制成平板，待冷却后，向平板中央接种新鲜真菌菌饼（8 mm），并设等量无菌水作为对照，每个处理各设4 个重复，置于30℃恒温箱中培养，待对照菌落长满整个培养皿的2/3 时，用十字交叉法测定菌落直径，抑菌率（P，%） 计算公式为：

式中：X为对照菌落直径（mm）；Y为处理菌落直径（mm）；Z为菌饼直径（mm）。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离与纯化

从怀化市麻阳县采集回来的30 个污染菌袋中分离得到20 种细菌菌株，经纯化2 次～3 次后置于4℃冰箱保存。

2.2 细菌对食用菌绿霉病病菌拮抗作用的测定

2.2.1 初筛

通过平板对峙，从20 种细菌中筛选得到5 种对木霉具有明显抑制作用的菌株，命名为me-1、me-2、me-3、me-4、me-5。由于拮抗细菌的抑制，木霉在培养基上无法全部伸展，靠近拮抗菌这一侧菌丝和孢子受到抑制，见图1a。

2.2.2 复筛

在管碟法试验中，由于拮抗菌株代谢物的拮抗作用，me-1、me-2、me-3、me-4、me-5 抑制了牛津杯周围木霉的生长，其中菌株me-1 的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到24.7 mm，见图1b，在1%和5%的显著水平上高于其他几种细菌，见表1。

由图1 可知，无论是平板划线的菌体还是无菌发酵过滤液，菌株me-1 对长枝木霉有明显的抑制作用，使得木霉无法继续扩展。

表1 不同拮抗菌对木霉的抑菌圈的大小Tab.1 The size of inhibition zone of different antagonistic bacteria against Trichoderma longibrachiatum

由表1 可知，不同的菌株对木霉的抑菌圈直径不同，表现出不同的抗性，其中，菌株me-1 对木霉的抑菌圈直径最大，为24.7 mm。

2.3 拮抗菌me-1 的分类鉴定

2.3.1 形态特征和生理生化性状

拮抗菌me-1 的形态特征见图2。

由图2 可知，菌株me-1 的形态特征为，菌落表面粗糙不透明，具有很多皱褶，白色或者微黄色。光学显微镜下观察发现菌体呈杆状，革兰氏阳性。电子显微镜下观察，菌体大小为（0.7～0.8） μm×（2.0～2.5） μm，菌体两个相接或分散，周生鞭毛。菌株me-1 的生理生化性状见表2。

表2 菌株me-1 的生化试验结果Tab.2 Biochemical test results of strain me-1

由表2 可知，经相关试验测定，菌株me-1 与枯草芽孢杆菌生化的试验结果完全一致。

2.3.2 菌株的分子生物学鉴定

经测定，菌株me-1 的分子生物学鉴定结果见图3、图4。

由图3 可知，16S rDNA 序列的全长为1 310 bp。

由图4 可知，BLAST 比对发现me-1 与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 相似度达到100%。用Mega 7 软件构建系统发育树发现，me-1 与Bacillus subtilis菌株HN-4 聚为一枝。同时结合形态特征与生理生化性状分析，将me-1 鉴定为枯草芽孢杆菌。

2.4 拮抗菌对不同食用菌的抑制作用

木霉拮抗菌me-1 对不同食用菌抑制作用结果见表3。

由表3 可知，拮抗菌对姬松茸（Agaricus blazei）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、大球盖菇（Stropharia rogosoannulata） 有抑制作用，而对黑木耳（Auricularia auricula）、灵芝、杏鲍菇，10 d 内都没有产生抑制作用，说明菌株me-1 不会抑制其菌丝的生长，但能抑制其病原菌木霉的扩展。

表3 菌株me-1 对不同食用菌的抑制作用Tab.3 Inhibition of me-1 strain to different edible fungi

2.5 抗菌谱试验

采用对峙培养法和生长速率法测定拮抗菌me-1对其他4 种常见食用菌病原菌的作用，结果见表4。

表4 me-1 对其他食用菌病原真菌的抑菌效果Tab.4 Antifungal effect of me-1 on other fungal pathogens of edible fungi

由表4 可知，拮抗菌me-1 发酵液除对黑木耳链孢霉病菌（Neurospora crassa） 无抑制作用外，对其他3 种供试真菌均有效果，抑菌率为64.2%～92.9%。其中，对黑木耳青霉病菌（Penicillium paneum） 的抑菌率达到了92.9%，在1%和5%显著水平上明显高于其他病菌。

3 讨论

从湖南省麻阳县采集的发病面积较小的绿霉病害样品中，分离筛选得到1 株对食用菌绿霉病菌有较强拮抗作用的菌株me-1，管碟法测得其对长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 的抑菌圈达到24.7 mm，经过培养性状、形态特征、生理生化性状和16S rDNA 测定，将其鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。抑制作用测定试验结果表明，该菌株不会抑制黑木耳、杏鲍菇和灵芝菌丝的生长，有较好的开发潜力。

目前，关于食用菌绿霉病生物防治的报道较少，张旭等[8]通过平板对峙和杯碟法筛选出了1 株地衣芽孢杆菌，其发酵液上清液对木霉抑菌圈为（19.02±1.65） mm，并确定其最适生长条件为温度37℃、pH 7.0、接种量为1%。陈发川等[17]通过稀释涂布平板法从芦荟和香蕉皮等植物和土壤中分离出了木霉拮抗菌，经鉴定为枯草芽孢杆菌。马林等[18]从土壤中分离得到对食用菌绿霉病有明显拮抗作用的菌株，该菌株MS82（荧光假单孢菌） 对双孢蘑菇的菌丝没有影响。国内外学者对木霉的研究一般是将其作为一种生防菌株，因其可以抗多种植物病害并且对环境友好，在植物病害的生物防治中起到越来越重要的作用[19-21]。长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 是食用菌污染料中常见的木霉种[22]，本研究从食用菌绿霉病害菌袋中分离得到5 株木霉拮抗菌，其中枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） me-1 抑制效果最好，抑菌圈达24.7 mm，为进一步开发安全、高效的食用菌绿霉病害的生防制剂提供了菌种资源。

枯草芽孢杆菌是一种优良的生防菌株，可以产生70 多种抗菌物质，如肽类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，其防病主要机制为营养竞争、诱导抗性、抗生作用和促生作用，并且具有繁殖快、营养简单、储藏时间长等特性[23]，已受到国内外学者的关注和研究。目前，我国利用枯草芽孢杆菌防治病害的研究已处于世界先进水平，成功开发投入生产的商品制剂有亚宝、百抗和纹曲灵等[24]。但目前关于枯草芽孢杆菌抗食用菌绿霉病的报道很少，本研究不仅分离出了对长枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 拮抗作用较好的枯草芽孢杆菌，而且经抗菌谱试验，表明枯草芽孢杆菌me-1 除对黑木耳链孢霉病菌无抑制作用外，对3 种其他常见食用菌病原真菌均有抑制作用，其对黑木耳青霉病菌的抑制率达92.9%，在1%和5%水平上显著高于其他2 种病原菌，有较好的应用前景，为对食用菌病害具广谱抗性的生防制剂的开发和利用提供了理论依据。