大球盖菇1 号的分离纯化及其液体培养基优化*

柏秋月，邓百万,2**，解修超,2，宁 静，常 宁

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西省食药用菌工程技术研究中心，陕西汉中723000）

大球盖菇（Stropharia rugoso-annulata） 属于担子菌门（Basidomycota） 球盖菇科（Strophariaceae）球盖菇属（Stropharia），又名皱球盖菇、酒红大球盖菇等[1]。其色泽艳丽、腿粗盖肥、食味清香，含有相当高的蛋白质和多种矿物质元素及维生素[2]。近年来研究发现，大球盖菇在改善冠心病[3]、降血糖[4]、抗氧化[5]、抑菌[6]等方面作用显著，且其作为世界交易的十大菇品种之一，需求量大，因此受到国内外众多学者的关注[7]。

近年来，我国食（药） 用菌产业发展迅速，传统的固体菌种由于培养周期长，生长缓慢，菌丝易老化，使得大球盖菇的大规模生产受到一定的限制。而液体菌种具有生长周期短，生长快，菌种纯度高，适合大规模生产等诸多优点[8]，更易于实现大球盖菇工业化、标准化、周年化生产。但大球盖菇的液体培养基菌体生长较慢，而目前对于食用菌的的培养基优化多采用单因素试验，其存在试验次数多、周期长和结果不准确等缺点[9]。因此，为提高试验结果的准确信，减少试验研究的工作量，研究以大球盖菇1 号子实体作为材料进行分离纯化，得到大球盖菇菌株，并通过Plackett-Burman 设计试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken 响应面分析试验对大球盖菇液体培养基组成进行优化，确定最优培养基配方，使大球盖菇1 号菌丝体在短期内生物量达到最大，弥补固体菌种在生产中的不足，以期为大球盖菇1号液体种的工业化生产提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试大球盖菇于2019 年5 月采自陕西省汉中市南郑县，品种为大球盖菇1 号，审定编号为川审菌2004 004。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1D 型单人超净工作台，上海苏净实业有限公司；YXQ-LS-50S 型高压灭菌锅，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；ZRD-A7230 鼓风干燥箱，上海智城分析仪器制造有限公司；FA2004 电子分析天平，上海精科天平有限公司；HWY-2112 型恒温培养箱，中国厦门医疗电子仪器厂；HWY-2112 型摇床，厦门德维科技有限公司；K960 型热循环PCR 仪，杭州晶格科学仪器有限公司；DYCZ-22A 型水平电泳仪，北京六一厂。

1.3 培养基

改良马铃薯培养基：土豆200 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、蛋白胨5 g·L-1、磷酸二氢钾5 g·L-1、硫酸镁3 g·L-1、VB10.1 g·L-1、琼脂15 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

基础培养基：蔗糖20 g·L-1、蛋白胨3 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、磷酸二氢钾3 g·L-1、硫酸镁2 g·L-1、玉米粉10 g·L-1、VB11 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

察式培养基：硝酸钠3 g·L-1、磷酸氢二钾1 g·L-1、硫酸镁0.5 g·L-1、氯化钾0.5 g·L-1、硫酸亚铁0.01 g·L-1、蔗糖30 g·L-1，H2O 1 L，pH 自然。

1.4 方法

1.4.1 菌种的分离纯化

将大球盖菇1 号子实体用无菌水冲洗干净后，先在75%酒精溶液中浸泡30 s，用无菌水冲洗后置于0.1%升汞溶液中浸泡5 min，再用无菌水冲洗5次~6 次后用无菌滤纸吸干其表面的水，置于垫有灭菌滤纸的平皿上[10]。用解剖刀取菌盖及菌柄与菌盖交界处取约6 mm 菌肉接种至马铃薯培养基中，于28℃培养箱下培养，得到大球盖菇1 号菌株004。

1.4.2 菌种形态鉴定及ITS 分子鉴定

将分离的大球盖菇1 号菌株004 接于察氏培养基上，取其菌丝采用棉蓝染色法在光学显微镜下对菌丝体的形态和大小进行鉴定[11]。

将分离的大球盖菇菌丝体利用十六烷基三甲基溴化铵法（CTAB 法） 提取DNA，并采用真菌通用引物ITS-1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 和ITS-4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’） 进行扩增。PCR 反应体系（30 μL）：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmoL·L-1上、下游引物各1 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 补至30 μL。PCR 反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，36 个循环；72℃延伸10 min。PCR 产物送上海生工生物工程有限公司测序[12]，将测得序列提交NCBI 数据库进行Blast 同源比对，使用MEGA 7.0软件分析，构建系统进化树，确定菌株分类地位。

1.4.3 菌丝球干质量测定方法

取1.00 cm2的大球盖菇1 号菌丝块接种于150 mL 基础液体培养基中，重复3 组，静置24 h 后于28℃，140 r·min-1摇床发酵10 d，将发酵液抽滤后，置于干燥箱中60℃烘干水分后称重，菌丝球干重（Y，g·150-1mL-1） 取平均值[13]。

1.4.4 Plackett-Burman 试验

以蔗糖（X1）、蛋白胨（X2）、酵母膏（X3）、KH2PO4（X4）、MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1（X7） 等因素为研究对象，进行Plackett-Burman 试验，按表1 和表3 配置液体培养基，每个处理设3个重复，菌丝球干重（Y） 取平均值，并采用Minitab 18 软件对数据进行统计分析。

表1 Plackett-Burman 试验设计表Tab.1 Plackett-Burman experimental design table

1.4.5 最陡爬坡试验

根据Plackett-Burman 试验的设计分析影响菌株004 菌丝体干重的因素，将正效应显著性因素逐步增加，负效应显著因素逐步减少，进行最陡爬坡试验，对于影响无统计学意义但使生物量升高的因素取“+1”水平，对于影响无统计学意义但使生物量降低的因素取“-1”水平[14]。

1.4.6 Box-Behnken 试验设计

根据最陡爬坡试验的结果，采用Box-Behnken中心复合实验设计原理，选取MgSO4（X5）、玉米粉（X6）、VB1(X7) 3 个因素作为自变量，对每个自变量的低、中、高水平分别以-1、0、+1 进行3 因素3水平的试验。每组实验重复3 次，菌丝球干重（Y）取平均值，因素和水平编码，如表2 所示。

表2 Box-Behnken 试验设计表Tab.2 Box-Behnken experimental design table

1.4.7 数据处理和分析

利用Minitab 18 软件对Plackett-Burman 试验结果进行方差分析，采用Design-Expert 8.0.6 软件对Box-Behnken 试验结果进行分析[15]。

2 结果与分析

2.1 菌株菌落形态及显微特征

菌株004 菌落形态与显微特征见图1。

由图1 可知，菌株004 的菌落形态及显微特征：菌落呈圆形，呈放射状蔓延；菌丝白色，丝状，气生菌丝较少，有多且明显双核菌丝[16]。

2.2 菌株序列分析

大球盖菇1 号菌株004 ITS 的扩增结果显示其序列大小在800 bp 左右。将菌种ITS 序列测序后，提交至GenBank 数据库中，进行序列分析和相似性比较，并建立系统发育树，见图2。

由图2 可知菌株004 与Strophariasp.ITS 基因序列具有99%相似率，说明其属于大球盖菇。

2.3 菌株004 初始生物量

将大球盖菇1 号菌株004 接种于150 mL 基础液体培养基中培养，测得3 组菌丝球干重分别为0.882 3 g·150-1mL-1、0.892 9 g·150-1mL-1、0.901 1 g·150-1mL-1。大球盖菇1 号菌株004 菌丝球干重平均值为0.892 1 g·150-1mL-1。

2.4 Plackett-Burman 设计试验结果

Plackett-Burman 设计生成的12 次试验，考察蔗糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、玉米粉、VB1等7 个因素对大球盖菇菌丝体干重（Y） 的影响，试验结果如表3 所示。利用软件Minitab 18 对试验结果进行分析，结果如表4 所示。

表3 Plackett-Burman 试验设计及响应值Tab.3 Plackett-Burman test design and response values

表4 Plackett-Burman 试验分析结果（已编码单位）Tab.4 Plackett-Burman experimental results (coded units)

由表3、表4 可知，MgSO4（X5）、玉米粉（X6）和VB1(X7) 为显著性因素，可作为进一步优化的因素。其中，X5和X7增加时，菌丝生物量增加有统计学意义（P<0.05），为正效应因素，而X6增加时，菌丝生物量降低有统计学意义（P<0.05），为负效应因素。

2.5 最陡爬坡试验结果

为了建立更有效的响应面拟合方程，必须进行最陡爬坡试验，最陡爬坡试验是以试验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长[17]。由PB 试验可知MgSO4、玉米粉、VB1对于大球盖菇生物量有显著影响，因此根据3 个因素效应的大小比例设定其变化步长进行最陡爬坡试验，试验设计及结果如表5 所示。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Tab.5 Design and results of steepest climbing test

表5 结果表明，在MgSO44.5 g·L-1、玉米粉4 g·L-1和VB12.6 g·L-1时，大球盖菇1 号菌株004 的菌丝球干重最大为1.141 3 g·150-1mL-1，应将此作为最佳响应区域。

2.6 Box-Behnken 试验设计与分析

根据表2 中的因素水平设计，利用Design-Expert 8.0.6 软件设计3 因素3 水平Box-Behnken 试验，结果如表6 所示。

表6 Box-Behnken 中心组合因素水平编码表Tab.6 Box-Behnken central composite factor horizontal coding table

表6 结果表明，X6X7项有统计学意义；X6、X7、X5X7、X52、X62、X72项极有统计学意义，X5、X5X6无统计学意义。模型P值为0.000 2，可信度为99.99%，因此模型有意义，二次回归方程可靠，失拟项无统计学意义（P值0.177 6>0.05），说明试验操作可信。运用Design-Expert 8.0.6 软件响应面分析程序对17 组试验的响应值进行回归分析，得到表8回归方程方差分析表。

表7 回归分析结果Tab.7 Regression analysis results

由表7 可知，R2=0.970 1，R2adj= 0.931 7。F值可得到X5、X6和X7对Y的影响顺序：X6>X7>X5，即玉米粉>VB1>MgSO4，利用Design-Expert 8.0.6 软件进行非线性的二次多项式拟合，得到的预测模型为：Y=-11.292 85+2.132 2X5+0.161 32X6+5.722 91X7-0.022 363X5X6+0.072 281X6X7-0.226 31X5X7-0.160 04X52-0.026 923X62-0.991 83X72。

2.7 响应面图分析

将一个因素固定在0 水平，做另外2 个因素交互作用的曲面图及等高线图[18]，确定MgSO4、玉米粉与VB1对大球盖菇菌丝生物量影响，如图3~图5。

由表7 可知，当以大球盖菇菌丝生物量为响应值时，MgSO4与玉米粉并无交互作用。由图3、图4和图5 可知，VB1与MgSO4和玉米粉的交互作用等高线图呈明显的椭圆形，说明交互作用显著，对大球盖菇菌丝生物量有显著影响。这可能是因为VB1作为生长因子，能够促进菌丝的生长。当VB1用量为2.5 g·L-1左右时，菌丝生物量达到最大。当VB1用量低于2.5 g·L-1时，菌丝生物量随着VB1的增加而增加，表明在此范围内，VB1与MgSO4和玉米粉具有协同左右，提高生长因子VB1的用量可促进菌丝的生长。当超过最佳用量时，菌丝生物量先降低后趋于稳定。这可能是因为当VB1超过一定用量时，又开始抑制菌丝的生长，因此会导致菌丝生物量的降低，但其机理尚不明确，有待进一步研究。

2.8 验证试验

采用Design-Expert 8.0.6 软件对最优结果进行预测，菌丝体干重（Y） 最大估值为1.193 3 g·150-1mL-1，对应的因素浓度为MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，即为最佳培养基配方。

为了验证响应面分析的可靠性，采用上述最佳培养基配方做验证性试验，最终得到菌株004 菌丝生物量为1.215 4 g·150-1mL-1，在基础培养条件下其菌丝生物量为0.892 1 g·150-1mL-1，优化后提高了36.2%，实测值与拟合值误差约为1.9%，结果表明，该模型的可靠性较高，可很好地预测试验结果，响应面法优化大球盖菇1 号液体培养基是可行有效的。

3 讨论

Plackett-Burman 设计主要用于关键参数的筛选，最陡爬坡试验用于在Plackett-Burman 设计试验结果的基础上进一步逼近最优区域。而响应面设计是从众多因子中寻找最佳组合的数学统计方法，能够对影响响应值的各因子及其交互作用进行全面评价，得到最优组合[19]。

通过采用Plackett-Burman 试验和响应面分析法考察了蔗糖、蛋白胨、玉米粉等7 个因素对大球盖菇1 号菌丝生物量的影响，并得到相应的预测模型，优化的液体培养基组分为蔗糖20 g·L-1、蛋白胨6 g·L-1、酵母膏2 g·L-1、KH2PO43.00 g·L-1、MgSO44.56 g·L-1、玉米粉4.25 g·L-1、VB12.43 g·L-1，对优化后的大球盖菇1 号液体培养基进行验证试验，测得最佳培养基的菌丝生物量提高36.2%，达到1.215 4 g·150-1mL-1，与模型预测结果相近，进一步验证了模型的可靠性。而孙清波等[20]运用单因素和正交试验优化大球盖菇液体培养基得到的菌丝生物量为0.6 g·150-1mL-1，低于本研究优化结果，证明本研究优化结果有效，能够为大球盖菇液体菌种的工业化生产提供一定的理论和依据。但本试验缺少对培养条件的优化，无法确定培养条件对菌丝生长的影响，因此在大球盖菇液体种的培养条件上仍需进行研究。