止血化瘀利水方对缺氧诱导ARPE-19 细胞VEGF 及HIF-1α 表达的影响

桑子瑾，吴文婷，陈强，吴烈，张佳良，梁丽娜

视网膜静脉阻塞（retinal vein occlusion,RVO）是常见的致盲性视网膜血管病之一，其预后差的主要原因是易出现眼部新生血管及与其相关的黄斑囊样水肿、玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离和新生血管性青光眼。眼部新生血管性疾病的共同病理改变是病理性新生血管形成。目前普遍认为新生血管的发生主要与缺血、缺氧有关，代谢应激（酸中毒）、力学应激（增生的细胞产生的压力）、免疫炎症反应等也是新生血管产生的因素[1]。RVO 发生后，视网膜血液回流发生障碍，管腔压力增高，小血管及毛细血管破裂出血，随后毛细血管闭塞形成无灌注区，使血-视网膜屏障遭到破坏，视网膜组织缺血缺氧，发生代偿反应，视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞增生，缺氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达增高，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等细胞因子持续表达，使脉络膜毛细血管内皮细胞不断分裂增生，形成新生血管［2］。VEGF 是眼部新生血管生成必不可少的诱导因子，是当前治疗新生血管性疾病的主要作用靶点。中药止血化瘀利水之法在RVO 所致黄斑水肿的临床治疗中取得了较为显著的效果［3-4］，理论上可以减少缺氧状态下RPE 细胞增殖及VEGF 的分泌，有效治疗新生血管性眼病。本研究通过使用化学低氧诱导剂CoCl2建立RPE 细胞缺氧模型，观察止血化瘀利水方对体外培养的人RPE 细胞HIF-1α及VEGF 表达的影响，初步探索中药治疗RVO 黄斑水肿的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

ARPE-19 细胞（上海富衡生物科技有限公司ATCC CRL-2302TM）、DMEM/F12 培养液（美国Hyclone 公司）、CoCl2（美国Sigma 公司）、CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所）、人VEGF ELISA 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，EK0539）、超纯RNA 提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，CW0581）、HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，CW0744）、SYBR Green PCR Mixture 试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，CW0957）、复方血栓通胶囊（广东众生药业股份有限公司，批号170206）、止血化瘀利水方（由中国中医科学院广安门医院药剂科提供，组成：桃仁、生蒲黄、当归、赤芍、生地黄、小蓟、茯苓皮、泽泻、侧柏叶、茜草炭、枳壳、柴胡）。

1.2 分组及建模

1.2.1 含药兔血清的制备 新西兰兔14 只，兔龄10～12 个月，体重2.3～2.5 kg，雌雄各半，随机分为3组：中药组5 只、阳性对照组5 只、空白对照组4 只。中药组：将止血化瘀利水方中药饮片每剂以2000 ml水煎制成200 ml 浓缩液，灌胃剂量相当于临床剂量2 倍，参考《药理实验方法学》折算[5]。每日给予止血化瘀利水方汤药灌胃1 次(每日9 时),给药剂量为5 ml/kg·d。阳性对照组：每日给予复方血栓通胶囊内容物灌胃1 次(每日9 时),给药剂量为0.245 g/kg·d。空白对照组：每日相同时间给予等剂量的蒸馏水。各组连续灌胃7 d 后全麻下腹主动脉采血制备无菌含药血清,-20℃保存备用。

1.2.2 ARPE-19 细胞的培养 购置冻存AREP-19细胞株，换含15%胎牛血清的DMEM/F12 培养液放入37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，次日按1:2 传代。细胞密度达90%时弃培养液，PBS 洗2 遍，加入0.25%的胰酶1 ml 消化3 min，镜下见细胞变圆，加入15%DMEM/F12 终止消化，吸管反复吹打，形成细胞悬液，一分为二接种于新的培养瓶中，置于培养箱，2～3 d 换液1 次。

1.2.3 CoCl2诱导RPE 细胞缺氧模型的建立 细胞接种于96 孔板中，每孔100 μl，培养24 h 后弃培养液，加入不含胎牛血清的DMEM/F12 培养24 h。分为正常组和不同浓度CoCl2组（25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L），每组设5 个复孔，每孔100 μl。37℃5%CO2培养箱中分别孵育24 h、48 h、72 h，每孔加入20 μl CCK-8，继续孵育4 h 后置于酶标仪上测450 nm 吸光度值。

1.3 含药血清对CoCl2诱导后ARPE-19 细胞增殖活性的影响

细胞接种于96 孔板中，每孔100 μl，培养24 h后弃培养液，加入不含胎牛血清的DMEM/F12 培养24 h。将ARPE-19 细胞分为正常组、缺氧模型组、含药血清干预组（分别予浓度为5%、10%、20%的止血化瘀利水方含药血清、复方血栓通含药血清、空白血清），每组设5 个复孔，每孔100 μl。37℃5%CO2培养箱中分别孵育24 h、48 h、72 h，每孔加入20 μl CCK-8，继续孵育4 h 后置于酶标仪上测450 nm 吸光度值。

1.4 ELISA 检测ARPE-19 细胞培养上清中VEGF的含量

细胞接种于24 孔板中，每孔1 ml，分为中药组、阳性对照组、空白对照组、缺氧模型组、正常组。中药组：加入CoCl2200 μmol/L 和止血化瘀利水方含药血清；阳性对照组：加入CoCl2200 μmol/L 和复方血栓通含药血清；空白对照组：加入CoCl2200 μmol/L和空白血清；缺氧模型组：加入含CoCl2200 μmol/L的DMEM；正常组：加入不含FBS 的DMEM。细胞悬液中加入血清或培养液后分别培养24 h、48 h、72 h后，收集培养上清。按照人VEGF ELISA 检测试剂盒说明进行操作。酶标仪上测450 nm 吸光度值，绘制标准曲线查出相应VEGF 浓度。

1.5 ARPE-19 细胞中HIF-1α 和VEGF mRNA 的表达

采用荧光定量PCR（real-time PCR）方法，Primer Premier5.0 软件设计引物，由上海生工全程合成。按照上述分组处理细胞，收集细胞，使用超纯RNA 提取试剂盒，按其说明书步骤操作提取RNA。使用HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒进行反转录，获得cDNA。以cDNA 为模板进行PCR 扩增，采用UltraSYBR Mixture 试剂盒建立扩增反应体系，将样品cDNA 各取1μl 做模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，对资料进行单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验和SNK 检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 建立缺氧细胞模型的最佳CoCl2浓度

5 个不同浓度CoCl2分别培养ARPE-19 细胞24h、48 h、72 h。25 μmol/L 和50 μmol/LCoCl2组与正常组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而100 μmol/L和200 μmol/L CoCl2组吸光度值均升高且差异有统计学意义（100 μmol/L 组：t24h=-2.158,P24h=0.037；t48h=-2.381,P48h=0.016；t72h=-4.108,P72h=0.004；200 μmol/L 组：t24h=-2.974,P24h=0.012；t48h=-4.247,P48h=0.001；t72h=-2.882,P72h=0.004）；400 μmol/L CoCl2组吸光度值降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。100 μmol/L、200 μmol/L浓度组间两两比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。200 μmol/L CoCl2组在24 h、48 h、72 h 吸光度值均最大，设立为缺氧细胞造模浓度（表1）。

表1 不同浓度CoCl2 对各时点ARPE-19 细胞增殖活性的影响（±s，n=5）

表1 不同浓度CoCl2 对各时点ARPE-19 细胞增殖活性的影响（±s，n=5）

注：* 与正常组同时间段比较，P＜0.05

2.2 止血化瘀利水方和复方血栓通含药兔血清的最佳浓度

不同浓度含药血清(5%、10%、20%)作用于缺氧化ARPE-19 细胞培养24 h、48 h、72 h。与缺氧模型组比较，5%止血化瘀利水方含药血清组差异无统计学意义（P＞0.05），10%和20%浓度组差异有统计学意义（10%组：t24h=2.944,P24h=0.002；t48h=2.044,P48h=0.023；t72h=2.530,P72h=0.030；20%组：t24h=4.305,P24h=0.001；t48h=2.588,P48h=0.003；t72h=3.517,P72h=0.018），而两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）；5%复方血栓通含药血清组在24 h 差异有统计学意义(t=2.786,P=0.013)，在48 h、72 h 差异无统计学意义（P＞0.05），10%和20%浓度组在24 h、48 h 差异有统计学意义(10%组：t24h=12.980,P24h＜0.001；t48h=3.787,P48h=0.003；20%组：t24h=11.680,P24h＜0.001；t48h=4.837,P48h=0.001)，在72 h差异无统计学意义（P＞0.05），10%和20%两组间差异均无统计学意义（P＞0.05）；各浓度空白血清组差异均无统计学意义（P＞0.05）。综合比较，20%浓度血清各组对缺氧模型细胞增殖活性影响最大，故选用于后续试验。结果提示止血化瘀利水方含药血清、复方血栓通含药血清对ARPE-19 细胞增殖均有抑制作用，前者的作用相对持久。

2.3 ARPE-19 细胞VEGF 蛋白浓度

ELISA 结果显示在24 h、48 h、72 h 3 个时间点，各组内VEGF 蛋白浓度均随时间推移呈递增趋势（表2）。与正常组比较，缺氧模型组差异有统计学意义(t24h=-9.794,P24h＜0.001；t48h=-7.447,P48h＜0.001；t72h=-10.466,P72h＜0.001)。与缺氧模型组比较，空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；阳性对照组、中药组差异均有统计学意义（阳性对照组：t24h=2.897,P24h=0.001；t48h=2.308,P48h=0.013；t72h=4.748,P72h＜0.001；中药组：t24h=4.242,P24h＜0.001；t48h=3.430,P48h＜0.001；t72h=2.501,P72h=0.006）。在48 h、72 h 阳性对照组与中药组两两比较差异有统计学意义（t48h=2.429,P48h=0.024；t72h=-1.933,P72h=0.036）。

2.4 各组ARPE-19 细胞HIF-1α 和VEGF mRNA的表达

HIF-1αmRNA：与正常组比较，缺氧模型组在24 h、48 h、72 h 差异均有统计学意义（t24h=-2.658,P24h=0.034；t48h=-6.150,P48h＜0.001；t72h=-3.203,P72h=0.006）。与缺氧模型组比较，空白对照组、阳性对照组、中药组在24 h、72 h 差异均无统计学意义（P＞0.05），在48 h，3 种血清对HIF-1α mRNA 表达均起到明显抑制作用，差异有统计学意义（t空白=16.822,P空白＜0.001；t阳性=14.918,P阳性＜0.001；t中药=15.358,P中药＜0.001），3 种血清间两两比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

VEGF mRNA：与正常组比较，缺氧模型组在24 h、48 h、72 h 差异均有统计学意义（t24h=-4.946,P24h＜0.001；t48h=-12.863,P48h＜0.001；t72h=-5.561,P72h=0.011）。与缺氧模型组比较，24 h、72 h 空白对照组差异无统计学意义（P＞0.05），阳性对照组与中药组差异均有统计学意义（阳性对照组：t24h=3.437,P24h=0.001；t72h=-2.219,P72h=0.031；中药组：t24h=3.084,P24h=0.003；t72h=-6.115,P72h=0.009），但两组间比较差异，无统计学意义（P＞0.05）；48 h，空白对照组、阳性对照组、中药组差异均具有统计学意义（t空白=4.676,P空白＜0.001；t阳性=13.554,P阳性＜0.001；t中药=14.837,P中药＜0.001），但阳性对照组和中药组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表2 ELISA 法测各组细胞吸光度值、VEGF 蛋白浓度(±s，n=5)

表2 ELISA 法测各组细胞吸光度值、VEGF 蛋白浓度(±s，n=5)

注：* 与缺氧模型组比较，P＜0.05；△阳性对照组与中药组比较，P＜0.05

表3 RT-PCR 测各组细胞相关因子mRNA 表达(±s，n=3)

表3 RT-PCR 测各组细胞相关因子mRNA 表达(±s，n=3)

注：* 与同指标同时间缺氧模型组比较，P＜0.05

3 讨论

RVO 发生后视网膜缺血缺氧，脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）相关并发症出现，如黄斑水肿、玻璃体积血等，严重影响患者视功能。CNV 的形成是一个多因素共同调节的复杂过程，缺氧是目前较为明确的原因，可以导致RPE 细胞内信号通路和细胞因子的表达变化。RPE 细胞位于视网膜神经上皮层和脉络膜之间，与视网膜光感受器细胞层、Bruch 膜及脉络膜毛细血管构成光感受器细胞-RPE-Bruch 膜-脉络膜毛细血管复合体，其与眼底新生血管性疾病的发生发展存在密切关系［6］。正常情况下，RPE 细胞以HIF-1α 非依赖途径分泌VEGF,通过RPE 与脉络膜新生血管之间的旁分泌信号转导在脉络膜稳态的维持中发挥关键作用；在缺氧状态下，RPE 细胞增殖、迁移，并通过HIF-1α 上调VEGF 的表达[7],Bruch 膜损伤，视网膜的稳态及完整性无法维持，最终形成脉络膜新生血管，视网膜光感受器细胞因缺乏脉络膜营养供应而凋亡［8］。

中医眼科学认为，RVO 合并黄斑水肿等新生血管相关并发症属于“络瘀暴盲”范畴，乃“久病入络”“败络丛生”之变证、恶证，“瘀”是其最主要的病理因素。根据《血证论》“瘀血化水，亦发水肿，是血病而兼水也”及《金匮要略·水气病脉证并治》“经为血，血不利则为水，名曰血分”等的病因病机论述，本研究认为针对RVO 合并黄斑水肿等新生血管相关性并发症仍然应从“血证论治”为主，宜“络病论治”“理血治水”故治以止血化瘀为主，兼利水消肿，这与现代医学采用玻璃体腔注射抗VEGF 制剂的思路有相似之处。课题组前期研究证实，十灰散可以调节RVO 凝血机制，有利于减少视网膜出血、水肿；血府逐瘀汤有助于调节视网膜微循环状态，从而改善缺血缺氧环境，抑制VEGF 生成和表达，减少CNV 并发症[9]。止血化瘀利水方是十灰散、血府逐瘀汤及五苓散化裁而成，方中以桃仁活血化瘀、生蒲黄凉血止血，共为君药；当归、赤芍助桃仁化瘀，生地黄、小蓟助生蒲黄凉血止血，当归、赤芍、生地黄并能滋阴养血补虚，茯苓皮运脾利水、泽泻泄热利湿，共为臣药；侧柏叶凉血止血、茜草炭凉血祛瘀，为佐助药；枳壳、柴胡行气以推动血行，为使药。诸药合用，共奏凉血止血、化瘀利水之功效。

本实验选用复方血栓通胶囊作为阳性对照药。有研究表明，复方血栓通成分可使糖尿病小鼠视网膜VEGF 表达降低[10]；补气活血中药干预可抑制VEGF的表达，达到减少和延缓视网膜新生血管的形成和发展的目的[11]；活血化瘀药物三七和丹参能减少血管增生性视网膜病变小鼠的VEGF 含量，可通过改善局部缺氧环境或影响各种新生血管生长因子而阻止视网膜新生血管形成[12]。结果表明，止血化瘀利水方和复方血栓通含药血清均能够抑制缺氧化ARPE-19 细胞的增殖，降低细胞中VEGF 蛋白含量，下调VEGF 和HIF-1α mRNA 表达，因此推测改善缺氧环境及抑制VEGF 是中药发挥作用的关键机制之一。止血化瘀利水方对ARPE-19 细胞增殖的抑制作用比复方血栓通更持久，前者在24 h、48 h 控制VEGF 蛋白表达水平更接近正常组，作用略强于后者；而二者在抑制VEGF 和HIF-1α mRNA 表达方面作用接近，差异无统计学意义。细胞模型到72 h时可能出现VEGF mRNA 表达自行下调。

本实验为中医临床“络病论治”“理血治水”治疗RVO 合并黄斑水肿等新生血管相关性并发症提供了初步的理论依据，为不同中医证型提供了更多的组方选择。止血化瘀利水方可用于治疗RVO 证属阴虚血热兼有血瘀水停者，复方血栓通胶囊则适用于治疗RVO 证属血瘀兼气阴两虚患者。