同型半胱氨酸通过抑制心肌线粒体自噬诱导线粒体损伤

张昕禹曹 妍严文静王 雯

(1.首科医科大学基础医学院生理学与病理生理学系;2.代谢紊乱相关心血管疾病北京市重点实验室，北京 100069)

同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)又称为高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸。在2018年高血压防治指南中将空腹血浆总Hcy水平≥15 μmol/L定义为高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia，HHcy)[1]。HHcy作为心血管疾病的独立危险因子，参与多种心血管疾病的发生发展[2]。由于心肌细胞收缩舒张需要大量的ATP，心脏是人体中能量消耗最多的器官。线粒体对于心肌的能量代谢至关重要。线粒体自噬是可清除受损线粒体，减少受损线粒体的蛋白外泄，发挥质量调控的作用，从而保护心肌细胞。多项研究表明，线粒体自噬对于维持心血管内环境稳定尤为重要[3-4]。那么，HHcy是否可以通过介导线粒体自噬受损，进而破坏线粒体结构和功能，最终导致心肌细胞损伤？本研究拟探讨线粒体自噬在Hcy诱导心肌细胞损伤中的作用，为进一步阐明HHcy导致心肌损伤的机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

SPF级雄性8周龄SD大鼠由首都医科大学实验动物中心提供;大鼠血浆Hcy浓度Elisa试剂盒(南京建成,中国);胎牛血清(Gibco公司，美国);高糖DMEM培养基(Hyclone公司,美国);Hcy试剂(Sigma-Aldrich公司,美国);Drp1抗体(Mouse mAb：14647，CST，美国)、COX IV抗体(Mouse mAb：11967，CST，美国)、LC3抗体(Rabbit mAb：12741，CST，美国)和PINK抗体(Rabbit mAb：ab23707，Abcam,美国);GAPDH抗体、山羊抗兔IgG/生物素标记、山羊抗小鼠IgG/生物素标记(中杉金桥,中国);ECL超敏二步法检测试剂盒(Merck Millipore公司,德国);ATP检测试剂盒(碧云天,中国)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)(碧云天,中国)；Western blot小垂直板电泳槽和电泳仪及凝胶成像系统(Bio-Rad公司,美国)；Spectra Max M2/M2e酶标仪(MD公司，美国)。

1.2 主要方法

1.2.1 HHcy大鼠模型建立及Hcy浓度的检测 高蛋氨酸饮食法构建HHcy大鼠模型。SD大鼠随机自由分组：正常饮食组和2.5%蛋氨酸饲料喂养组,6个月后,Elisa试剂盒检测大鼠血浆Hcy浓度确定造模成功。实验严格按照试剂盒流程操作。

1.2.2 细胞培养及分组 将H9C2细胞置于含1%双抗和10%FBS的DMEM高糖培养基以及95%O2、5%CO2、37 ℃培养箱孵育。待细胞复苏贴壁及形态状态完好后,隔天换液培养,当细胞密度达到30%～40%进行传代至6孔板继续培养。实验分组：Control组、Hcy组。根据预实验结果选择时间点及刺激浓度，进行后续实验操作。

1.2.3 LC3和COX IV免疫荧光共定位染色 将心脏组织冰冻切片从-80 ℃冰箱取出，50 ℃烘箱烘片20 min，用PBS漂洗5 min×3次,10%多聚甲醛固定10 min,再用PBS漂洗5 min×3次，2%Triton处理10 min，用PBS漂洗5 min×3次，1%BSA封闭1 h，甩掉封闭液,同时加入LC3和COX IV抗体(1:200),4 ℃孵育过夜;隔日,室温30 min,PBS漂洗5 min×3次,滴加荧光二抗,37 ℃水浴锅1 h，PBS漂洗5 min×3次，DAPI染核5 min。荧光显微镜观察并拍照。

1.2.4 透射电镜观察线粒体超微结构 将约1 mm3新鲜心肌组织迅速固定于2.5%戊二醛溶液中4 h，PB漂洗10 min×3次，进行标本制备(上述操作均在4 ℃进行)。透射电镜下观察并拍照。

1.2.5 JC-1法检测线粒体膜电位 当6孔板细胞密度达30%～40%,给予细胞500 μM Hcy共孵育48 h。在1×PBS中重悬细胞，用流式细胞仪进行进行细胞筛选分析；进行细胞爬片用共聚焦显微镜观察并拍照。实验严格按照JC-1试剂盒流程操作。

1.2.6 18F-FDG PET/CT检测心肌对葡萄糖的摄取 将大鼠置于固定器中，经鼠尾静脉注入显像剂18F-FDG，经过1 h完全吸收后，麻醉后仰卧位进行数据采集。先行CT扫描，再行PET扫描。SUV计算公式：SUV=局部感兴趣区放射性活度(MBq/mL)/注射放射性活度(MBq)/体质量(g)。

1.2.7 心肌ATP检测 常规提取心肌组织裂解液，加100 μL ATP检测工作液到避光孔内。在避光孔内加上20 μL样品或标准品，迅速用微量移液器混匀。至少间隔2秒后，用化学发光仪测定RLU值。测定样品中的蛋白浓度，根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度，然后把ATP的浓度换算成nmol/mg蛋白的形式进行标化。

1.2.8 Western blot 从-80 ℃取出组织，用RIPA裂解液(含1%蛋白酶抑制剂)进行裂解,超声破碎，4 ℃、14 000 rpm离心20 min，上清即为蛋白提取液。BCA法检测蛋白浓度。加入30 μg蛋白样品，以80～120 V的SDS-PAGE电泳条件分离蛋白,后以恒压100 V、1.5 h的电转条件将目的蛋白转移至PVDF膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h后孵育一抗,4 ℃过夜。常规洗膜孵育二抗,加入ECL超敏发光液，Bio-Rad凝胶成像系统曝光,得到灰色条带。通过Image Lab软件进行分析。

1.3 统计学分析

数据统计均采用Prism6.0软件进行分析,并以均数±标准差表示。采用t检验进行比较,P<0.05即认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 HHcy大鼠模型构建成功

采用2.5%蛋氨酸饮食饲养SD大鼠6个月后，其血浆Hcy浓度显著高于正常饮食饲养的大鼠，提示HHcy大鼠模型构建成功(图1)。

图1 大鼠血清Hcy浓度*P<0.05 vs Control, n=9

2.2 HHcy大鼠心肌组织线粒体自噬水平下降

首先对大鼠心肌组织冰冻切片进行线粒体标志LC3-COX IV免疫荧光共定位染色。镜下观察发现，与对照组相比，HHcy 组心肌组织线粒体中LC3(自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3)表达下调(图2A)，其荧光强度下降；线粒体动态的分裂/融合过程也对线粒体自噬有着重要影响。我们采用Western blot法对大鼠心肌组织中线粒体融合/分裂的标记蛋白Drp1(动力相关蛋白1)和介导线粒体自噬的PINK-Parkin通路中PINK的蛋白表达量进行检测。结果发现，与对照组相比，HHcy组心肌组织中Drp1和PINK蛋白的表达均减少(图2B)，提示HHcy大鼠心肌线粒体自噬降低。

图2 HHcy大鼠心肌线粒体自噬水平的改变A:大鼠心肌线粒体自噬LC3-COX IV免疫荧光共定位染色(20×)；B:大鼠心肌线粒体分裂/融合标记蛋白和PINK-Parkin通路蛋白表达情况*P<0.05 vs Control, n=5

2.3 HHcy大鼠心肌线粒体结构受损

我们进一步探究HHcy介导的线粒体自噬不足是否能够引起线粒体的损伤。首先，通过透射电镜对HHcy模型大鼠心肌的线粒体微观结构进行观察。结果显示与对照组大鼠相比，HHcy大鼠心肌的线粒体排列紊乱，轮廓模糊，膜破损溶解，嵴消失(图3A)；接着，给予H9C2细胞Hcy刺激48 h，进行JC-1染色，结果表明，与对照组相比，Hcy导致线粒体膜电位下降(图3B)，进一步提示心肌细胞中的线粒体结构受损。

图3 HHcy大鼠心肌组织线粒体结构的改变A: 透射电镜观察大鼠心肌组织中线粒体超微结构；B:Hcy刺激H9C2观察线粒体膜电位(MMP)的变化*P<0.05 vs Control, n=5

2.4 HHcy大鼠心肌组织线粒体功能受损

生理情况下，心肌细胞所需的ATP主要来自线粒体的氧化代谢，极少量来源于糖酵解。在有氧条件下，正常心脏优先利用脂肪酸。为探究HHcy对心脏能量代谢情况的影响， 我们通过18F-FDG PET/CT对HHcy大鼠心肌葡萄糖摄取情况进行检测。结果发现，HHcy大鼠心肌的葡萄糖摄取率增加(图4A)，提示HHcy大鼠心肌对能量物质的利用发生改变，心肌对能量底物代谢从优先利用脂肪酸向利用葡萄糖转变，是心肌能量代谢失衡的表现之一。我们进一步对大鼠心肌组织中的ATP含量进行检测。结果显示，HHcy大鼠心肌组织中ATP含量降低，提示HHcy大鼠心肌线粒体能量供应障碍(图4B)。

图4 HHcy大鼠心肌线粒体功能的改变A:18F-FDG PET/CT观察大鼠心肌葡萄糖摄取情况；B:大鼠心肌线粒体ATP含量的变化*P<0.05 vs Control，n=5

3 讨 论

多项研究表明，血浆Hcy病理性升高是心脑血管疾病的独立危险因素，但是关于HHcy造成心脑血管疾病的具体机制尚不明确。在神经元中，线粒体自噬在代谢稳态、能量供应、神经元存活和健康中起着重要作用。线粒体自噬缺陷会导致受损线粒体的积累和细胞功能障碍，引起衰老和年龄易感性神经退化[5]。与神经元类似，心肌细胞也是终末分化细胞，且一直在不停的收缩与舒张，消耗大量的能量。线粒体是心肌细胞能量代谢的重要细胞器。而线粒体自噬是维持线粒体能量供应的有效机制[6]。近年来，线粒体自噬的激活被认为是具有心脏保护性的。例如PTEN介导的线粒体自噬可防止心脏缺氧/复氧损伤[7]，Ulk1/Rab9介导的线粒体自噬在能量应激期间提供心脏保护作用[8]。线粒体自噬还可以保护心脏免受糖尿病损伤[7]，且抑制Sirt3-Foxo3A-Parkin信号介导的线粒体自噬的下调可能在糖尿病心肌病的发展中起重要作用[9-10]。多项研究表明，Hcy 能够抑制自噬的发生[11]，Hcy能够通过mTOR信号通路抑制乳鼠心肌细胞自噬的发生[12]，也能通过 AMPK/mTOR信号通路抑制平滑肌细胞自噬[13]。线粒体自噬是一种选择性自噬，Hcy是否也能影响心肌细胞的线粒体自噬及线粒体功能，鲜少报道。

本研究通过免疫荧光共定位染色和Western blot检测了HHcy大鼠心肌组织线粒体自噬的发生情况，结果提示，HHcy 组心肌组织线粒体中自噬关键相关蛋白 LC3表达下调；同时还发现调控线粒体自噬的分裂/融合蛋白中，HHcy组心肌组织中介导分裂的Drp减少，PINK-Parkin信号通路相关蛋白PINK1降低；以上均提示HHcy大鼠的心肌组织中线粒体自噬水平明显降低。为进一步验证在此过程中线粒体自噬的不足是否会引起线粒体的损伤，我们对线粒体形态结构进行观察，结果发现HHcy大鼠的心肌组织中线粒体排列紊乱，轮廓模糊，膜破损溶解，嵴消失；进而又在离体细胞水平发现，Hcy导致线粒体膜电位降低。最后，我们又对线粒体功能进行检测，结果发现HHcy大鼠的心肌组织中线粒体对葡萄糖的摄取增加，ATP产生减少，提示HHcy大鼠心肌线粒体能量代谢障碍。

综上，本研究表明在HHcy可能是通过降低线粒体自噬的发生，进而损伤线粒体的结构和功能, 最终导致心肌细胞死亡。这可能是HHcy参与心脑血管疾病的关键机制之一。本研究扩展了HHcy对心肌损伤的机制研究, 为防治HHcy导致的心血管疾病提供了新的思路和实验依据。