近冰温冷藏对‘金冠’苹果贮藏品质的影响

舒 畅，刘帮迪，张万立，曹建康，姜微波

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

‘金冠’苹果（Malus × domesticaBorkh. cv. Golden Delicious）又称黄元帅、黄香蕉，其产量高、果形饱满、肉质细密、品质优良，为我国重要的苹果栽培品种；但是其耐贮性差，在贮藏期间果实易失水褶皱、软化严重、品质下降迅速，属于不耐贮藏的品种[1-2]。苹果中含有绿原酸、咖啡酸、表儿茶素等丰富的多酚类物质，具有抗氧化、抗肿瘤、预防心血管疾病、降脂降血糖等多种生物活性[3]。为了延长‘金冠’苹果的贮藏时间、提高贮藏品质、保持营养价值，研究其贮藏保鲜方法具有一定的实际意义。

近冰温（near freezing temperature，NFT）冷藏技术是将果实贮藏温度设为0 ℃以下并稳定保持在果实生物结冰点温度附近的一种贮藏技术[4]。通常情况下，有生命特性的果蔬产品在0 ℃左右贮藏，称之为冷藏，而0 ℃以下则称为冻藏，主要应用于无生命特性的食品原料如鱼、肉等[5]。果蔬组织结冰点低于0 ℃，在0 ℃以下、生物结冰点以上的温度贮藏，生物组织不会冻结并仍然能保持活体状态。研究发现果蔬产品在生物结冰点附近温度贮藏的效果明显要优于0 ℃以上贮藏[6]。NFT冷藏技术被认为是是继机械冷藏、气调贮藏后的第三代保鲜技术[7]。

果蔬组织中除含水分外，还含有可溶性糖、有机酸、矿物质、可溶性蛋白等溶质，这使得果蔬组织的结冰点低于0 ℃。此外，果实组织内的高分子化合物形成的网状空间结构和植物细胞形成的致密结构使得水分子的扩散受到一定程度的限制。这些因素可以使果实组织不易冻结，使得非冷害敏感果蔬可以长期在0 ℃以下冰点以上的温度下贮藏。当果蔬产品的贮藏温度稳定在冰温范围内时，果蔬组织细胞生命活动受到极大的抑制，成熟衰老进程大幅降低，果蔬用以维持生命体征消耗的能量最小，从而达到维持果实品质、延长贮藏期、控制果实衰老的目的[4,8]。

NFT冷藏是一种新型物理保鲜方法，已经在蓝 莓[9-10]、葡萄[11]、柿[12]、樱桃[13-14]、杏[15-17]、油桃[18]、西兰花[19]、生菜[20]等多种果蔬产品上进行了应用研究，均表现出较好的贮藏效果。然而，鲜有关于‘金冠’苹果近冰点贮藏的报道。‘金冠’苹果在传统低温贮藏过程中品质劣变迅速、软化严重，不耐贮藏。研究‘金冠’苹果的近冰点贮藏方法具有实际意义。

本实验以‘金冠’苹果为试材，研究了NFT贮藏、传统低温贮藏对‘金冠’苹果贮藏过程中品质指标的变化。通过比较两种贮藏条件下果实各项指标参数，研究NFT贮藏‘金冠’苹果的可行性，以期为‘金冠’苹果的NFT贮藏保鲜技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘金冠’苹果，于2017年9月27日采自北京市某果园，随机从树上选取位置、大小、成熟度一致，无病虫害和机械损伤的果实，纸箱包装当天运回实验室。果实初始硬度为8.16 kg/cm2，可溶性固形物质量分数 为13.5%。

甲醇、乙酸（色谱级） 美国赛默飞世尔科技有限公司；氢氧化钠、碳酸钙、丙酮、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、二硫苏糖醇（分析纯） 北京化工厂；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

GY-1型果实硬度计 杭州托普仪器有限公司；PAL-1便携式手持折光仪 日本爱宕公司；Rc-4型温度记录仪 江苏精创电气股份有限公司；GC-7890F型气相色谱仪 上海天美公司；3NH型精密色差仪 深圳 三恩驰科技有限公司；LC-20AB型高效液相色谱仪 日本岛津公司；DDS-11A型电导率仪 上海今迈仪器有限公司；T6新世纪型紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 果实处理

经过挑选的苹果果实在温度为（4f 1）℃、相对湿度（85f 5）%条件下充分预冷24 h。样品分成2 组，置于衬有16 μm聚乙烯微孔袋的纸壳箱内，分别在环境温度为（0.0f 0.5）℃（普通冷藏）、（－1.7f 0.2）℃（NFT贮藏）条件下贮藏240 d。分别在第30、60、120、180、240天测定各项指标，切取果实赤道部分中间果肉和果皮，果肉迅速切成小块放入液氮中冷冻，再置 于－80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续各指标的测定。每次实验随机取8 个果实，每个处理设置3 次重复。

1.3.2 果实NFT的测定

参考Zhao Handong等[18]的方法，采用冻结法测定苹果果实的冰点温度。随机选取10 个成熟度一致、大小均匀的果实，将温度记录仪的探头完全刺入果实果肉中，将果实放入－18 ℃的冷冻室中，记录仪检测温度，每10 s自动记录一次温度，将数据导入计算机。根据绘制的冻结曲线确定苹果果实的NFT。

1.3.3 乙烯释放速率和呼吸速率的测定

待测果实需转至20 ℃下回温2 h，以保证所测组别的苹果果实在测试过程中的温度保持一致。每个组别选取6 个大小、颜色一致的果实置于体积4 L的玻璃缸中，用橡胶活塞密闭，在20 ℃静置2 h后顶空抽取1 mL缸内气体，用气相色谱法测定乙烯和CO2浓度。所用气相色谱设备包括GC-7890F气相色谱仪、GH-300A氢气发生器、氢火焰离子检测器、甲烷转化炉和氧化铝不锈钢柱（2 mh 3 mm）。采用外标法进行定量计算，乙烯释放速率单位为μL/（kgg h），呼吸速率单位为μg/（kgg h）。

1.3.4 果实硬度、可溶性固形物质量分数、可滴定酸质量分数、色泽、叶绿素含量、质量损失率的测定

采用GY-1手持式硬度计测量果实赤道部位硬度，探头直径为3.5 mm；可溶性固形物质量分数（soluble solids content，SSC）采用阿贝折光仪测定；可滴定酸质量分数测定参考曹建康等[21]的方法，采用酸碱滴定法测定，结果以苹果酸换算。果实色泽采用色差仪测定；果皮叶绿素含量参考曹建康等[21]的方法，采用分光光度法测定，单位为mg/g，结果以鲜质量计。果实质量损失率参考李玉娟等[22]的方法，采用称质量法测定。

1.3.5 相对电导率和丙二醛含量的测定

相对电导率测定参考曹建康等[21]的方法，采用电导率仪测定；丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法[23]测定，结果以鲜质量计。

1.3.6 抗坏血酸含量测定

抗坏血酸含量测定参考Liu Hui等[24]的方法，采用高效液相色谱法测定，并稍作修改。称取2 g苹果果肉组织于研钵中，加入10 mL 20 mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 2.1，含1 mmol/L乙二胺四乙酸）低温研磨成匀浆，在16 000hg、4 ℃下冷冻离心20 min，取上清液为抗坏血酸提取液。向抗坏血酸提取液中加入2 g/L二硫苏糖醇（m（提取液）∶V（二硫苏糖醇）＝4∶1），混匀。用0.22 μm的水系滤膜过滤后进入高效液相色谱仪测定。高效液相色谱仪包括：LC-20AT泵、SPD-M20A二极管阵列检测器和C18反相柱（250 mmh 4.6 mm ，5 μm）。流动相A为体积分数1%乙酸溶液，流动相B为体积分数10%甲醇溶液。等度洗脱，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，进样体积为20 μL，检测波长为280 nm。外标法定量，单位为mg/100 g，结果以鲜质量计。

1.3.7 总酚、总黄酮含量和抗氧化能力的测定

总酚的提取参考Liu Hui等[24]的方法，总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu比色法，以没食子酸作为标准物质，单位为mg/kg，结果以鲜质量计。总黄酮含量的测定参考Mohd等[25]的方法，采用分光光度法测定，以芦丁作为标准物质，单位为mg/kg，结果以鲜质量计。

抗氧化能力测定参考Zhao Handong[18]和Wang Zhen[26]等的方法，包括2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic)，ABTS）阳离子自由基清除能力实验、 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-d i p h e n y l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力实验和铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power，FRAP）实验。以水溶性VE（Trolox）作为基准物质，单位为μmol/g，结果以鲜质量计。

1.4 数据处理与分析

所有实验在取样时进行3 次生物学重复，指标测定时进行3 次技术重复，实验结果表示为平均值±标准差。所有数据利用Origin 8.5软件进行整理绘图。数据之间的差异性通过IBM SPSS Statistics 19软件Duncan’s多重比较法分析（P＜0.05表示差异显著）。

2 结果与分析

2.1 ‘金冠’苹果NFT的确定

图 1 ‘金冠’苹果的冻结曲线（A）和生物结冰点（B）Fig. 1 Freezing point curves of ‘Golden Delicious’ apple (A) and plot showing biological freezing point (B)

如图1A所示，果实在冻结过程中温度迅速下降，首先下降至过冷点，然后组织中的水分发生相变并释放潜热，温度迅速回升至生物结冰点温度，然后进入冰晶形成带，温度继续下降。如图1B所示，‘金冠’苹果的过冷点为－2.0 ℃，生物结冰点为－1.4 ℃，NFT贮藏的实际温度不能低于果实的过冷点，所以确定‘金冠’苹果NFT为（－1.7f 0.2）℃。

2.2 ‘金冠’苹果NFT冷藏过程中乙烯释放速率和呼吸速率的变化

图 2 0 ℃和NFT冷藏过程中苹果果实的乙烯释放速率（A）和 呼吸速率（B）的变化Fig. 2 Changes in ethylene production (A) and respiration rate (B) of apple fruit during cold storage at 0 ℃ and NFT

苹果是典型的呼吸跃变型果实，果实的呼吸代谢与多种营养物质的分解代谢相关，因此呼吸速率和乙烯释放速率能反映果实的生命进程，是评价果实贮藏特性和品质的重要指标[27]。在保证果实基本代谢的前提下，降低其呼吸作用和乙烯释放可以减少果实营养物质消耗，保持贮藏品质。由图2A可知，在贮藏期间，0 ℃和NFT贮藏组均出现了乙烯释放高峰，NFT贮藏推迟了乙烯释放高峰的出现，并且显著地降低了乙烯释放速率 （P＜0.05），NFT贮藏组的乙烯释放高峰的速率为0 ℃贮藏组的76.4%。NFT贮藏减少了乙烯释放量，减缓了贮藏过程中果实的成熟与衰老。由图2B可知，贮藏期间0 ℃和NFT贮藏组均出现了呼吸高峰，NFT贮藏推迟了呼吸高峰的出现，显著降低了果实呼吸速率（P＜0.05）。以上结果表明，NFT贮藏能明显抑制‘金冠’苹果在贮藏期间呼吸强度升高，推迟乙烯高峰出现，减少乙烯释放量，起到较好的采后贮藏效果。

当果实在生物结冰点温度附近贮藏时，外界温度尚达不到果实的过冷点，果实始终处于非冻结状态（亦称“玻璃态”），这种状态下果实内的自由水扩散速率极低[28]，细胞中需要水参与的各种酶促化学反应均受到极大的抑制，果实新陈代谢速率被抑制，从而影响果实的呼吸强度和乙烯合成代谢，延缓果实成熟和衰老[29]。

2.3 NFT冷藏过程中果实色泽和果皮叶绿素含量的变化

图 3 0 ℃和NFT冷藏过程中苹果果实的L*（A）、a*（B）、 b*（C）值和果皮叶绿素含量（D）Fig. 3 Changes in color L* (A), a* (B) and b* (C) and chlorophyll content (D) of apple fruit during cold storage at 0 ℃ and NFT

果皮的颜色不仅影响果实感官品质，而且也体现了果实的生理状态[30]。由图3A可知，两个组别果实的L*值都呈现不断上升的趋势，表明贮藏过程中苹果果皮的光泽亮度不断增加。贮藏180 d后，0 ℃贮藏组果实的L*值下降，表明果实开始衰老，表皮颜色变暗。由图3B可知，相较于0 ℃贮藏，NFT贮藏能明显地减缓苹果表皮a*值的上升（P＜0.05），推迟了果实表面绿色消退的过程。由图3C可知，0 ℃下果实的b*值呈逐步上升趋势，NFT贮藏的果实b*值在贮藏后期一直保持在较低的水平，在贮藏后期显著低于0 ℃贮藏组（P＜0.05），表明果实变黄减缓。果皮叶绿素含量的变化也证明了果实由绿变黄的变化被推迟。由图3D可知，在贮藏240 d后，NFT贮藏的果皮叶绿素含量为0.22 mg/g，是0 ℃贮藏组叶绿素含量的1.5 倍（P＜0.05）。

图 4 0 ℃和NFT冷藏240 d后苹果果实外观状态Fig. 4 Appearance of apple fruit after cold storage at 0 ℃ and NFT

由图4可知，贮藏0 d的果实表面呈新鲜果实的绿色，果梗饱满。贮藏240 d后，0 ℃贮藏组果实呈金黄色，表面颜色发暗，果肉颜色加深，果梗萎蔫失水并发生褐变。而NFT贮藏的果实呈明亮的黄绿色，果肉颜色变亮，果梗饱满，褐变面积小。综上可知，NFT贮藏可有效减缓果实色泽的转变，保持果实外观形态。

‘金冠’苹果在成熟的过程中，果皮颜色呈现出由“绿”转“白”再转“黄”的趋势。果实的绿色减少而黄色增加，在色泽参数上主要体现为a*值和b*值的增加，这个过程主要与叶绿素的降解和类胡萝卜素的合成有关[31]。果实在成熟前，叶绿素的合成速率较快，果实呈现绿色。而果实开始成熟时，叶绿素合成速率减慢，其他色素开始沉着，使得果实颜色变黄[32]。L*值表示果实表面的亮度，一般新鲜的果实表面色泽光亮而衰老果实表面暗淡。图3A的结果表明‘金冠’苹果在贮藏过程中L*值缓慢上升。这主要是由于在成熟的过程中，果皮的颜色先由“绿色”向“亮绿”色转变，然后再向黄色转变的缘故[33]，贮藏后期表面的褐斑增多，L*值下降。综上可知，NFT贮藏可以推迟果实的成熟，有效抑制果实色泽的转变。

2.4 NFT冷藏过程中果实硬度、SSC、可滴定酸质量分数和质量损失率的变化

图 5 NFT冷藏过程中苹果果实的硬度（A）、SSC（B）、 可滴定酸质量分数（C）和质量损失率（D）的变化Fig. 5 Effect of NFT storage on firmness (A), soluble solids content (B), titratable acid content (C) and mass loss rate (D) of apple fruit

由图5A可知，果实在贮藏过程中硬度呈下降趋势。从贮藏120 d开始，NFT贮藏苹果的硬度显著高于0 ℃贮藏苹果的硬度（P＜0.05）。当贮藏240 d时，NFT贮藏果实的硬度为4.45 kg/cm2，比0 ℃贮藏苹果的硬度高23.2%。这表明NFT贮藏可明显减缓苹果软化进程，维持果实硬度。

由图5B可知，苹果果实的SSC呈先上升后下降的趋势，NFT贮藏减缓了果实中SSC的变化，并使SSC在贮藏后期仍保持在较高水平。NFT贮藏组果实在180 d和240 d时比0 ℃贮藏组分别高8.6%和5.8%。因此，NFT贮藏可显著减缓苹果可溶性固形物的消耗（P＜0.05），维持果实品质。

由图5C可知，贮藏过程中苹果果实可滴定酸质量分数呈下降趋势，NFT贮藏显著抑制果实中可滴定酸质量分数的下降（P＜0.05）。在整个贮藏过程中，NFT贮藏果实的可滴定酸质量分数始终高于0 ℃贮藏的果实。NFT贮藏240 d后的果实可滴定酸质量分数为0.38%，仍高于0 ℃贮藏180 d苹果果实的可滴定酸质量分数。

由于贮藏过程中的水分蒸腾和呼吸消耗，苹果果实的质量损失率呈上升趋势（图5D）。从贮藏120 d开始，NFT贮藏的果实质量损失率显著低于0 ℃贮藏的果实 （P＜0.05）。NFT贮藏180 d和240 d的果实质量损失率分别是0 ℃贮藏果实质量损失率的79.3%和80.5%。

‘金冠’苹果属于典型的“易发绵”品种，在贮藏期间硬度下降严重，其主要原因是由于细胞间的中胶层逐渐溶解分离，细胞间产生空隙，果肉变软[2]。NFT贮藏可以降低苹果呼吸和乙烯释放速率，抑制果实的成熟，从而减少果实硬度的下降。NFT贮藏延缓果实软化的机理可能是由于抑制了果胶代谢相关酶（多聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、果胶甲酯酶和纤维素酶）的活性及相关基因的表达，保持了果实细胞的完整性，进而延缓果实的软化进程[4]。

SSC是反映果实质量和成熟状态的重要因素。与在0 ℃下贮藏的果实相比，NFT贮藏显著延缓了果实中SSC的下降（P＜0.05），有效地保持了果实的品质。可滴定酸质量分数在两组中均下降，可滴定酸质量分数与果实中的有机酸含量有关，其下降表明果实中的代谢可能发生变化[34]。这些结果表明，NFT贮藏可在贮藏期间维持苹果果实的品质。

2.5 NFT冷藏过程中果实膜透性和MDA含量的变化

图 6 NFT贮藏过程中苹果果实相对电导率（A）和 MDA含量（B）的变化Fig. 6 Effect of NFT storage on membrane permeability (A) and MDA content (B) of apple fruit

细胞膜透性反映果实的衰老程度，细胞膜透性的上升表明植物细胞膜被破坏[27]，而MDA是生物膜系统脂质过氧化的产物之一，其含量反映脂质过氧化强度和膜系统损伤程度[35]。由图6可知，随着贮藏时间的延长，苹果果实的膜透性不断增加、MDA不断积累。从贮藏120 d开始，与0 ℃贮藏相比，苹果在NFT贮藏期间的膜透性和MDA含量均保持较低的水平。在贮藏240 d后，NFT贮藏果实的膜透性、MDA含量分别是0 ℃贮藏果实膜透性的87.2%、89.4%。这说明NFT贮藏能显著减缓贮藏期间果实膜透性的上升（P＜0.05），减少MDA的积累，延缓果实衰老。

2.6 NFT冷藏过程中果实抗坏血酸、总酚、总黄酮含量的变化

图 7 NFT贮藏过程中苹果果实抗坏血酸（A）、总酚（B）、 总黄酮（C）含量的变化Fig. 7 Effect of NFT storage on contents of ascorbic acid (A), total phenols (B), total flavonoids (C) in apple fruit

如图7A所示，在贮藏240 d后，NFT贮藏的果实抗坏血酸含量与贮藏初期相比减少了44.4%，而0 ℃贮藏组的抗坏血酸含量下降了52.4%。抗坏血酸是果实中的重要营养成分，在贮藏过程中容易氧化分解，低温冷藏可以减缓抗坏血酸的损失[36]。与传统的0 ℃贮藏相比，NFT贮藏可以减少贮藏期间抗坏血酸的损失，保持果实的抗坏血酸含量和营养品质。

苹果是酚类化合物最重要的膳食来源之一，苹果中的多酚和黄酮物质具有抗氧化活性，能够清除自由基，延缓许多慢性疾病和脂质过氧化的进程[36]。如 图7B、C所示，总酚和总黄酮含量呈现类似的趋势。酚类和总黄酮含量在贮藏初期缓慢降低，在贮藏后期降低速率加快，这与之前的研究结果[37]趋势一致。NFT贮藏显著抑制了贮藏期间苹果果实中总酚和总黄酮含量的下降。在贮藏240 d后，NFT贮藏的总酚、黄酮含量比0 ℃贮藏组分别高17.4%、7.5%。多酚和类黄酮含量的变化与果实的成熟有关[38]。综上，NFT贮藏可以延缓苹果果实的成熟并保持多酚和黄酮的含量。

2.7 NFT冷藏过程中‘金冠’苹果果实抗氧化能力的变化

图 8 NFT贮藏过程中苹果果实ABTS阳离子自由基（A）、 DPPH自由基（B）清除能力和FRAP（C）的变化Fig. 8 Changes in ABTS cation radical scavenging capacity (A), DPPH radical scavenging capacity (B) and FRAP (C) of apple fruit during storage at 0 ℃ and NFT

由图8可知，本实验中所测定的3 种抗氧化能力，即ABTS阳离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和FRAP的变化趋势基本保持一致，并且与抗坏血酸、总酚和总黄酮含量的变化趋势一致，在贮藏过程中呈初期缓慢下降、后期快速下降的趋势。相比于0 ℃贮藏，NFT贮藏的果实在贮藏后期具有更高的抗氧化能力。贮藏240 d时，NFT贮藏果实的ABTS阳离子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力和FRAP分别比0 ℃贮藏的果实高10.0%、10.5%和10.2%。结果表明NFT贮藏显著提高了果实的抗氧化活性（P＜0.05）。抗坏血酸、多酚和总黄酮含量变化可能会影响抗氧化活性。因此本研究表明，NFT贮藏可以有效地保持苹果果实的品质并增强其抗氧化能力。

3 结 论

本实验以‘金冠’苹果为试材，研究了NFT贮藏对苹果果实品质的影响。NFT贮藏可以显著抑制苹果果实的呼吸强度和乙烯释放速率，推迟呼吸高峰出现时间，保持较高的SSC、可滴定酸质量分数、总酚含量、总黄酮含量和抗氧化能力，减缓MDA的积累和细胞膜透性的增加。NFT贮藏240 d后的苹果果实色泽鲜亮，失水率低。因此，NFT贮藏可提高‘金冠’苹果贮藏品质。