LPS对骨肉瘤细胞迁移、侵袭及TLR4/HOTAIR通路的影响

郝家欣 方 昕 夏 荧

骨肉瘤是1种原发性恶性骨肿瘤，常发生在青少年的干骺端。由于其恶性程度极高，因此简单的手术切除通常治疗效果不佳[1]。尽管近几十年经过国内外研究人员的研究，在骨肉瘤的诊断和治疗方面已经取得了重大进展，但骨肉瘤患者的总体存活率并未发生显著变化[2]。原发性骨肉瘤向邻近组织和器官的转移一直是导致骨肉瘤患者治疗失败和存活率低的主要问题[3]。因此，了解骨肉瘤转移中涉及的机制一直是研究的重要内容。肿瘤侵袭和转移主要涉及细胞粘附、迁移、增殖、细胞外基质降解、肿瘤血管生成和侵袭转移等复杂的过程[4]。越来越多的证据表明肿瘤微环境中的许多组分参与肿瘤侵袭和转移，包括一些炎症因子[5]。因此，它们在肿瘤侵袭中的作用值得进一步研究。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌外膜的组分，也是肿瘤微环境中的重要因子[6]，其可通过激活细胞表面上的Toll样受体来影响肿瘤侵袭[7]。但是LPS对骨肉瘤细胞侵袭的作用机制还未彻底阐明。因此本研究采用LPS干预人MG-63骨肉瘤细胞模拟肿瘤炎症微环境，探讨LPS对MG-63细胞迁移及侵袭的影响及其潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及分组

人MG-63骨肉瘤细胞系购自美国ATCC细胞中心。将细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。将细胞随机分为两组：对照组和LPS组。

1.2 干预方式

将细胞以5×103个/孔的密度种植于96孔板，依照分组，每组6孔。培养24 h后，LPS组细胞用10 g/ml的LPS干预24 h，对照组用生理盐水干预。干预24 h后，收集细胞，进行后续检测。

1.3 ELISA

分别采用上海碧云天公司提供的人TNF-α、IL-1和IL-6ELISA试剂盒检测两组细胞培养基中促炎因子TNF-α、IL-1和IL-6的释放水平。

1.4 细胞迁移和侵袭分析

采用Transwell实验检测两组细胞的迁移及侵袭水平。细胞侵袭实验：首先，将5 μl的Matrigel平铺于Transwell 24孔板的上室中。然后将收集的两组细胞以1×105个/ml的密度重悬于无血清的培养基中，取500 μl的细胞悬浮液种植于每个上室中，并将500 μl含10%胎牛血清的培养基加入至下室中。于37 ℃、5% CO2孵育24 h后，用4%多聚甲醛固定侵入底室的细胞20 min，并用0.1%结晶紫染色30 min。最后在光学显微镜下计数染色的细胞，随机选取8个视野(×200)，统计每个视野中的侵袭细胞数，取平均值。细胞迁移实验：除不预铺Matrigel胶外，其余步骤同细胞侵袭实验。

1.5 Western Blot

采用RIPA试剂提取两组细胞中的总蛋白，BCA试剂盒进行总蛋白定量分析。取20 g总蛋白加入上样缓冲液中，用10%SDS-PAGE胶分离总蛋白，将总蛋白转至PVDF膜上，5%胎牛血清封闭45 min，加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，加入二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗3次，ECL暗室发光。采用Image J软件统计分析目的蛋白的相对表达量，GAPDH为内参。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 LPS对MG-63细胞培养基中炎症因子释放的影响

与对照组相比，LPS组培养基中促炎因子TNF-、IL-1和IL-6的释放水平均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组促炎因子对比[(±s)，(pg·ml-1)]

表1 两组促炎因子对比[(±s)，(pg·ml-1)]

组别TNF-αIL-1βIL-6对照组24.83±4.7751.35±9.9486.60±17.49LPS组165.19±8.52472.91±28.072362.59±74.43t35.21134.67772.917P0.0010.0010.001

2.2 LPS对MG-63细胞迁移和侵袭的影响

如表2所示，与对照组相比，LPS组迁移细胞数和侵袭细胞数均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组细胞迁移和侵袭对比[(±s)，视野]

表2 两组细胞迁移和侵袭对比[(±s)，视野]

组别迁移细胞数侵袭细胞数对照组182.69±11.3563.28±9.43LPS组370.24±26.72147.39±15.85t15.82511.171P0.0010.001

2.3 LPS对MG-63细胞EMT的影响

与对照组相比，LPS组中E-cadherin的表达水平显著降低(P<0.05)，而N-cadherin、-SMA和波形蛋白的表达水平均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组EMT相关蛋白对比(±s)

表3 两组EMT相关蛋白对比(±s)

组别E-cadherinN-cadherinα-SMA波形蛋白对照组0.93±0.150.31±0.080.40±0.110.49±0.10LPS组0.25±0.090.66±0.171.27±0.291.42±0.37t9.5224.5636.8715.944P0.0010.0020.0010.001

2.4 LPS对MG-63细胞TLR4/HOTAIR通路的影响

如表4所示，与对照组相比，LPS组TLR4和HOTAIR的表达均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 两组TLR4/HOTAIR通路相关分子对比

3 讨论

上皮间充质转化(EMT)是上皮细胞转化为间充质细胞表型的过程，它是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的分子基础。研究表明，肿瘤细胞上皮表型中E-cadherin的下调或缺失是EMT发生的重要标志，间质表型标志物如N-cadherin、波形蛋白和-SMA的上调也是EMT发生的重要标志[8]。随着对EMT的深入研究，越来越多的证据表明肿瘤微环境中的物质可促进EMT的发生，如LPS和TGF-1[9]。因此，LPS可作为1种激动剂，在体外诱导炎症反应以刺激炎症因子的分泌，用来研究肿瘤微环境组分对EMT、肿瘤侵袭和转移的调节作用及机制。由于原发性骨肉瘤向邻近组织和器官的转移是限制骨肉瘤治疗的主要问题，因此了解微环境在骨肉瘤侵袭和转移中的作用将为临床治疗提供重要依据。

LPS是革兰氏阴性细菌的主要成分，存在于肿瘤环境中，可通过特异性识别TLR4受体在肿瘤增殖、侵袭中发挥重要的调节作用。研究发现，LPS可通过TLR4/JNK途径促进肝癌中EMT的发生[10]。另有研究也发现，miRNAs参与LPS诱导的胰腺癌细胞增殖和转移[11]。还有，LPS可通过调控lncRNA在炎症过程中发挥关键的调节作用[12]。这些研究意味着lncRNA在LPS发挥其作用的机制中起重要作用。越来越多的证据表明，lncRNA在骨肉瘤的发生和发展中起着重要的调节作用。Li等[13]的研究发现，lncRNA UCA1可促进骨肉瘤的增殖和侵袭。Sun等[14]也证实lncRNA EWSAT1促进骨肉瘤细胞的增殖和发育。Ye[15]和他的同事证明了lncRNA GAS5可抑制骨肉瘤细胞增殖和EMT发生。这些研究进一步表明lncRNA在骨肉瘤肿瘤发展中具有重要的调节作用。

在本研究中，我们探讨了LPS在骨肉瘤细胞侵袭和转移中的作用。首先，我们采用10 g/ml 的LPS干预人骨肉瘤细胞系MG-63以验证LPS对骨肉瘤细胞迁移和侵袭的作用。结果表明，LPS干预24 h后，细胞培养基中TNF-、IL-1和IL-6这些促炎因子的水平显著增加，提示LPS可有效引发炎症环境，且LPS干预后导致骨肉瘤细胞的侵袭和转移能力显著增加，这与朱的研究结果一致[16]。由于EMT是肿瘤侵袭和转移的分子基础，因此我们进一步分析了LPS在骨肉瘤细胞EMT中的作用，以阐明LPS促进肿瘤侵袭和转移的机制。Western blot证实LPS可下调上皮标志物E-cadherin的表达，同时促进间充质标志物N-cadherin、波形蛋白和-SMA的表达。这些结果显示LPS可促进骨肉瘤细胞中的EMT，这与Li[10]的结果一致。研究表明，创伤或感染等应激下导致的局部炎症反应可启动骨再生，主要是通过动员造血干细胞和间叶干细胞分化形成血管网络、软骨和骨[9]。因此我们推测，肿瘤炎症环境也可诱导骨肿瘤干细胞分化增殖，这可能是经手术切除治疗的骨肉瘤患者易复发及转移的潜在原因。

TLR4是LPS的受体，我们的研究也证实了这一点，LPS干预24 h后可显著增加TLR4的表达，提示TLR4可能参与LPS诱导的EMT发生。此外，我们还发现，LPS干预24 h后，lncRNA HOTAIR的表达显著增加，这与Obaid等[17]的研究结果一致。因此推测HOTAIR可能是TLR4的下游调节分子，TLR4直接或间接促进HOTAIR的表达，进而促进EMT发生，导致骨髓瘤细胞的迁移和侵袭。但是TLR4调控的HOTAIR的机制还有待进一步研究。虽然已有研究证实HOTAIR可通过调控组蛋白H3赖氨酸的乙酰化向甲基化转化来促进胃癌中EMT的发生[18]，但HOTAIR促进骨肉瘤EMT发生的详细机制还有待研究。

总之，LPS诱导的肿瘤微环境可促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭，其机制与TLR4/HOTAIR途径介导的EMT过程的发生有密切关系。本研究结果揭示了LPS在肿瘤微环境中对骨肉瘤细胞侵袭和转移的影响，并提出了调节这些作用的潜在机制，为骨肉瘤的治疗及预防提供新思路及实验依据。