α-烯醇化酶在舌鳞状细胞癌患者顺铂化疗耐药中的作用及其临床意义

张 琼 郑国沛 何利珍

舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)是最常见的头颈部鳞状细胞癌，恶性度高、侵袭性强，患者预后差，5年生存率仅50%左右[1]。由于舌癌早期症状不明显，致使部分患者确诊时已属中晚期，因此单纯的手术切除难以达到理想的预后效果，此时化疗在整个治疗过程中的独特优势就显现出来。顺铂作为舌癌常用的化疗药物，在治疗中显示了明显的疗效，但是随着治疗时间的延长，患者会对其出现耐药现象，这也是治疗失败的主要原因。

我们在前期研究中通过平阳霉素(PYM)诱导产生了人TSCC多药耐药细胞株Tca8113/PYM，MTT实验显示其对包括顺铂在内的多种抗肿瘤药物表现出多药耐药性。与其亲本细胞相比，Tca8113/PYM细胞中α-烯醇化酶(α-enolase，ENO1)蛋白表达水平上调[2]。ENO1是糖酵解过程中的关键酶，近年来研究发现ENO1与肿瘤化疗耐药密切相关。本文旨在探讨ENO1在TSCC患者化疗耐药中的作用，及其与临床病理特征、预后的关系。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人TSCC细胞株SCC-15、SCC-25购自美国ATCC，Tca8113细胞及其多药耐药细胞株Tca8113/PYM为本室保存，以含10%小牛血清RPMI-1640完全培养液常规培养于37 ℃、5% CO2培养箱中。

1.2 Westen blot

取对数生长期细胞制备单细胞悬液(5×103个/ml)，接种到96孔培养板中，每孔加180 μl，培养24 h后分别加入5 mg/l顺铂，每种细胞设4个复孔，培养2周后收集细胞。加入细胞裂解液抽提细胞总蛋白后，BCA法测定蛋白浓度。 将 60 μg总蛋白进10% SDS-PAGE分离，蛋白湿转电转移至硝酸纤维膜上。用5%脱脂牛奶室温封闭2 h后，与第一抗体室温孵育2 h，洗膜3次后，将膜与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的第二抗体室温孵育1 h，洗膜3次后用化学发光试剂ECL(enhanced chemiluminescence)发光、显影和定影。

1.3 临床资料

收集2011年1月至2012年12月广州医科大学附属肿瘤医院病理科87例TSCC石蜡标本。所有患者均接受顺铂化疗，并且临床检查未见远处转移。患者通过电话或门诊随访，用药后2年内每3个月1次，2年后每半年1次。总生存时间计算按从首次顺铂治疗日开始至死亡或最后随访截止日，随访截止时间2017 年12 月31日。本研究通过医院伦理委员会批准，均取得患者知情同意。

1.4 免疫组化

所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，免疫组化采用EnVision两步法，操作按试剂盒说明书进行。PBS 代替一抗为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。以胞膜和胞质呈现黄色、棕黄色颗粒为阳性。

1.5 统计学分析

统计学处理应用SPSS19.0软件进行统计学数据处理，ENO1表达与TSCC患者临床病理特征的关系用χ2检验，对生存数据应用Kaplan-Meier分析并绘制生存曲线，应用Log-rank检验差异。

2 结果

2.1 ENO1在舌癌细胞系中的蛋白表达

为了探讨ENO1在化疗中的作用，我们检测了一系列TSCC细胞中ENO1蛋白表达改变。顺铂处理后，各细胞系中ENO1蛋白表达水平均升高(图1)。

2.2 ENO1表达与TSCC临床病理特征的关系

87例TSCC患者标本中ENO1高表达51例(58.62%)，ENO1低表达36例(41.38%)。ENO1高表达与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及复发密切相关(P<0.05)，与患者年龄、性别及分化程度无相关性(P>0.05)，见表1。

表1 ENO1表达与TSCC临床病理特征的关系/例

2.3 ENO1表达与TSCC患者预后的关系

TSCC患者ENO1高表达者中位生存时间(46.00±4.08)个月，低表达者中位生存时间(70.00±10.05)个月，ENO1高表达者中位生存期明显短于低表达者，2组相比差异有统计学意义(t=7.447，P=0.006)，见图2。

图2 ENO1高表达与低表达者生存曲线

3 讨论

ENO1是由2个含有433个氨基酸、分子质量约47 kD的亚单位构成的二聚体，是一种糖酵解酶限速酶，是影响细胞能量代谢的重要因素。近年来的研究发现ENO1的功能不仅仅限于催化糖酵解反应，它可能是一个在肿瘤发生、发展、转移等多个过程中均发挥重要作用的癌基因[3-4]，在多种肿瘤中表达升高。后续研究发现ENO1与肿瘤化疗耐药关系密切。Shi等[5]通过比较蛋白质组研究显示，阿霉素耐药性髓系白血病细胞中ENO1蛋白表达升高。Chen等[6]也发现氨甲蝶呤诱导产生的耐药性乳腺癌MCF-7/MTX细胞与药物敏感性MCF-7细胞相比，ENO1蛋白表达水平上调。有研究发现[7]，与其亲本细胞CNE-2相比，多西他赛耐药性鼻咽癌细胞CNE-2R中ENO1蛋白水平显著升高。shRNA抑制ENO1表达后，CNE-2R细胞对多西他赛的敏感性恢复。过表达ENO1能使CNE-2细胞产生获得性多西他赛耐药。同时，在耐药性鼻咽癌患者的标本中也发现ENO1蛋白及RNA水平上调。在我们的研究中发现顺铂处理细胞后，SCC-15、SCC-25、Tca8113及Tca8113/PYM细胞中ENO1蛋白表达升高，与前述研究结果一致。

放化疗等抗肿瘤治疗通过诱发自由基杀灭肿瘤细胞。细胞内ENO1蛋白水平上调后，糖酵解增强，细胞还原能力增强，阻断过氧化途径，消除代谢过程中产生的过氧化物，从而促进药物耐受形成[8-9]。此外，增强的糖酵解影响细胞内微环境，葡萄糖浓度变得更低，同时乳酸、丙酮酸及ATP含量升高[10]。细胞内低浓度葡萄糖能使葡萄糖转运蛋白表达增加，激活PI3K/AKT/mTOR通路以抑制凋亡、有利于细胞生存[11]。乳酸升高能增强DNA修复，通过失活组蛋白脱乙酰基酶，促进宫颈癌细胞中顺铂耐药[12]。丙酮酸通过上调P糖蛋白表达，增强化疗药物外排而促进化疗耐药[13]。ATP被认为是维持多药耐药表型的一种重要因素，ATP水平升高能直接活化带有ATP结合元件的转运体，将细胞内的毒性药物排出[14]。Chen等[6]发现在氨甲喋呤耐药性乳腺癌细胞MCF-7中ENO1 mRNA水平轻度下降，与Peng等[7]研究结果不同。还有研究[15]发现ENO1调节PI3K/AKT信号通路，在淋巴细胞粘附介导的药物耐药中起到重要作用。

在TSCC患者中，ENO1高表达与较高的TNM分期、淋巴结转移及复发具有显著相关性，表明ENO1在肿瘤发展、转移过程中发挥重要作用。ENO1蛋白高表达提示患者预后较差。我们的研究结果，提示升高的ENO1可成为舌癌新疗法的靶标，对于舌鳞状细胞癌精准治疗具有重要意义。