表皮生长因子受体19、21 外显子突变丰度与NSCLC 患者临床特征及吉非替尼疗效的关系

李苏霞 蒋亦燕 陈细秀 王鹏飞 杨晓蕾

靶向治疗是目前非小细胞肺癌（non small cell lung cancer，NSCLC）的重要治疗方法，其中吉非替尼是临床应用最广的NSCLC 靶向治疗药物[1]。吉非替尼是表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor -tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），能够竞争性地与表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶结合，通过抑制其活性而阻断EGFR 下游信号传导通路，发挥抑制肿瘤恶性增殖、转移等作用[2]。多项临床研究已证实，EGFR 基因突变状态是EGFR-TKI 疗效的重要预测指标[3-4]。近年临床发现，同为携带EGFR 基因敏感突变的NSCLC 患者，EGFR-TKI 治疗的中位无进展生存期（progression free survival，PFS）差异明显[5]。这可能与EGFR 基因突变丰度有关。本研究检测NSCLC 患者EGFR19、21外显子突变类型及突变丰度，探讨EGFR19、21 外显子突变丰度与NSCLC 患者临床病理特征及吉非替尼疗效的关系。现报道如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2013 年10 月—2016 年11 月温州医科大学附属第一医院收治的NSCLC 患者94例，其中男53 例，女41 例，年龄（60.58±10.16）岁；吸烟史42 例（44.68%）；病理类型：腺癌75 例，非腺癌19 例；临床分期：Ⅱ期24 例，Ⅲ期56 例，Ⅳ期14 例。本研究经医院伦理委员会审核通过。

1.2 纳入、排除标准 纳入标准：（1）经组织病理学检查确诊为NSCLC 且符合相关诊断标准，并经TNM分期标准进行临床分期[6]；（2）临床病理资料完整；（3）病理组织EGFR 突变为阳性；（4）进行吉非替尼治疗；（5）患者均对本研究知情且签署知情同意书。排除标准：（1）非EGFR 突变；（2）合并其他可能危及患者生命安全的严重疾病；（3）合并控制性差的严重糖尿病、心血管疾病、高血压等；（4）无法进行生存随访；（5）合并其他器官恶性肿瘤。

2 方 法

2.1 EGFR19 和21 外显子突变检测 收集NSCLC患者血液，使用DP318-02 血液基因组DNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，批号20130921）提取血液DNA，测定A260nm/280nm 吸光度。参照GenBank 数据库中人EGFR 基因序列，设计EGFR19、21 外显子检测引物：EGFR19 正向5'-GTGCATCGCTGGTAACATCC-3'，反向5'-TGTGGAGATGAGCAGGGTCT-3'；EGFR21 正 向5'-GCTCAGAGCCTGGCATGAAC-3'，反向5'-CATCCTCCCCTGCATGTGTT-3'。引物合成由上海生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用PCR 扩增目的片段，程序：94℃，5min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，40 个循环；72℃，10min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并采用琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20130826）回收纯化DNA 产物。将回收纯化的DNA 产物送至华大基因，使用IIIumina 高通量测序平台直接测序，结果于GenBank 数据库中人EGFR 基因序列比对，检测EGFR19、21 外显子突变情况。同时采用ARMS 法定性定量检测EGFR19、21外显子突变。将直接测序法和ARMS 法同时检测为EGFR 突变，且突变类型一致的病例，定义为高丰度组；直接测序法未检出EGFR 突变但ARMS 法检测出突变的患者，定义为低丰度组。

2.2 治疗方法及疗效评价 采用吉非替尼片（AstraZeneca UK Limited，规格：0.25g/片，批 号20130911）口服进行靶向治疗，每天1 片。治疗4 周后，行胸部CT、外周血肿瘤标志物等检查。

2.3 疗效标准 参照实体瘤疗效评估标准（version 1.1）评估治疗效果[7]，完全缓解（complete response，CR）：所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4 周；部分缓解（partial response，PR）：靶病灶最大径之和减少≥30%，至少维持4 周；疾病稳定（stable disease，SD）：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD；疾病进展（progressive disease，PD）：靶病灶最大径之和至少增加≥20%，或出现新病灶。疾病控制率=（CR+PR+SD）/总例数×100%。

2.4 生存随访 对患者生存期进行随访，截止时间2018 年12 月31 日。PFS 为第1 次使用吉非替尼片治疗开始至病情发生进展或死亡的总时间，总生存率（overall survival，OS）为截止随访时间患者病情未进展或死亡的例数。

2.5 统计学方法 应用SPSS 22.0 统计软件分析数据，计量资料用平均数±标准差（）表示，采用两独立样本t 检验两组间差异性，计数资料用百分数（%）表示，采用χ2检验组间差异性，绘制高丰度组和低丰度组Kaplan-Meier 生存曲线，采用Log Rank 法检验两组生存率差异，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 EGFR19、21 外显子突变情况 94 例患者经直接测序法或ARMS 法检测结果，EGFR19 外显子片段性缺失突变59 例（62.77%），EGFR21 外显子L858R 点突变35 例（37.23%），EGFR19 外显子片段性缺失+EGFR21 外显子L858R 点双突变2 例（2.13%）。其中被2 种方法同时检测到突变且突变类型一致的48 例，为高丰度组；直接测序法未检出突变而ARMS 法检测为突变的46 例，为低丰度组。

3.2 EGFR19、21 外显子突变丰度与NSCLC 患者临床病理特征的关系 EGFR19、21 外显子突变丰度在性别、年龄、吸烟史、TNM 分期等方面差异无统计学意义（P＞0.05）；腺癌患者EGFR19、21 外显子突变高丰度比例高于非腺癌患者（P＜0.05），组织中高分化患者EGFR19、21 外显子突变高丰度比例高于低分化患者（P＜0.05）；EGFR19、21 外显子突变丰度在病理类型、组织分化程度等方面差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

3.3 EGFR19、21 外显子突变丰度与吉非替尼疗效的关系 EGFR19、21 外显子突变高丰度组疾病控制率89.58%，低丰度组疾病控制率63.04%，两组疾病控制率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 EGFR19、21 外显子突变丰度与NSCLC 患者临床病理特征的关系[例（%）]

表2 EGFR19、21 外显子突变丰度与吉非替尼疗效的关系[例（%）]

3.4 EGFR19、21 外显子突变丰度与生存期的关系94 例患者截止至随访时间，死亡45 例，生存49 例，OS 为52.13%，PFS 为（14.06±3.57）个月。其中高丰度组OS 为64.58%（31/48），低丰度组OS 为39.13%（18/46），两组OS 比较，差异有统计学意义（χ2=6.098，P=0.014）。高丰度组中位PFS 为（15.98±3.24）个月，低丰度组中位PFS 为（12.06±2.87）个月，两组中位PFS 比较，差异有统计学意义（t=6.199，P=0.000）。见图1。

4 讨论

研究表明，EGFR 主要分布于细胞膜表面，为跨膜糖蛋白，包括胞内酪氨酸激酶活化区、跨膜区和胞外配体结合区[8]。EGFR 基因是重要的肿瘤驱动基因之一，在促进肿瘤增殖、转移、血管生成等过程中发挥重要作用，是NSCLC 临床靶向治疗的重要靶点[9]。

图1 高丰度组和低丰度组Kaplan-Meier 生存函数分析

吉非替尼靶向治疗NSCLC 的疗效取决于EGFR基因突变[10]。然而，有研究发现，同为携带EGFR 基因敏感突变的NSCLC 人群，一部分患者规范服用EGFR-TKI 类药物6 个月左右便出现疾病进展，而另一部分患者EGFR-TKI 治疗的PFS 可长达1～2年[11]。针对这一问题，部分学者研究认为与EGFR 突变类型有关，即EGFR19 外显子片段化缺失突变的临床疗效优于EGFR21 外显子L858R 突变[12]。但相关研究的样本量往往偏小，而在一些大型临床实验中未能证实此论断。有学者[13]提出EGFR 基因突变丰度存在个体差异可能是影响吉非替尼（EGFR-TKI）疗效的重要原因，并证实EGFR 基因高突变丰度组患者EGFR-TKI 治疗的PFS 明显长于低突变丰度组患者。

研究表明，血浆EGFR 突变检测可作为早期NSCLC 的生物标志物[14]。本研究选择94 例EGFR 基因突变患者血液为样本，进行直接测序法和ARMS法检测EGFR 基因突变类型及突变丰度，结果EGFR19 外显子片段性缺失突变率62.77%，EGFR21外显子L858R 点突变率37.23%，EGFR19、21 外显子双突变率2.13%。48 例患者同时被直接测序和ARMS 法检测到同一类型突变，表明EGFR 突变丰度相对较高。进一步分析发现，EGFR 突变丰度在NSCLC 病理分型、组织分化程度之间存在差异，主要表现为腺癌、组织中高分化患者EGFR 突变丰度相对较高，与高宁等[15]、娄冲等[16]研究结果相似。

Wang 等[17]研究表明，EGFR 基因突变的丰度较高的NSCLC 患者PFS 较低突变丰度患者改善；Li等[18]研究表明，EGFR 基因突变丰度与EGFR-TKI 治疗疗效显著相关，EGFR 基因突变低丰度可能对NSCLC 患者PFS 产生不利影响。本研究结果显示，EGFR 基因突变高丰度组使用吉非替尼治疗的疾病控制率89.58%，而低丰度组疾病控制率63.04%，高丰度组使用吉非替尼治疗的疾病控制率显著高于低丰度组。分析两组患者PFS 和OS 发现，高丰度组患者PFS 较低丰度组明显延长，OS 明显高于低丰度组，说明EGFR 基因突变丰度与NSCLC 患者吉非替尼治疗疗效及预后密切相关。

综上所述，NSCLC 患者EGFR 基因突变丰度的高低与临床病理分型、组织分化程度及吉非替尼治疗疗效有关，突变丰度高的患者吉非替尼治疗疗效相对较好，患者PFS 和OS 明显延长。本研究不足之处在于应用直接测序法和ARMS 法检测EGFR 基因突变丰度存在一定局限性，而本研究重点在于验证EGFR 基因突变丰度与NSCLC 患者临床病理特征及吉非替尼疗效的关系，因此仍需进一步探索新的定量检测EGFR 基因突变丰度的方法。