鹿瓜多肽穴位注射结合运动疗法对膝骨关节炎模型大鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原、血清MMP-3 水平的影响

谭同才 余艳梅 程瑞动

膝关节骨关节炎是临床上常见的疾病，其主要临床特点为关节软骨进行性退变，严重影响患者生活质量[1]。鹿瓜多肽具有消炎镇痛、促进成骨、调节骨代谢和促进创伤修复等作用。研究表明，鹿瓜多肽穴位注射治疗老年性膝关节炎有良好疗效[2]，已被广泛应用于临床。随着康复医学的发展，运动疗法在延缓老年膝关节骨关节炎进展中的作用越来越明确，但有关鹿瓜多肽联合运动疗法治疗膝关节骨关节炎研究报道尤其基础研究较少[3]。本研究观察鹿瓜多肽穴位注射结合运动疗法对膝骨关节炎模型大鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原、血清MMP-3 水平的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 实验动物 4 周龄雄性Sprague Dawley 大鼠48只，体质量（200±20）g，购自中科院上海实验动物中心，动物实验条件合格证：SYXK（浙）2013-0184，实验者动物实验证号：X1803347。按国家标准啮齿类动物饲养，动物房室温18～22℃，相对湿度40%～60%，每天明暗时间各为12h，自由摄食饮水。所有大鼠实验之前均未进行跑台运动实验及其他刺激。

1.2 主要仪器与试剂 动物跑步机（型号FT-200，成都泰盟科技有限公司，中国）；显微镜（Olympus 公司，日本）；弗氏完全佐剂、蕃红-O 染料（Sigma 公司，美国）；基质金属蛋白酶3（MMP-3）ELISA 试剂盒（批号ab53015，Santa Cruz Biotechnology 公司，美国）。

2 实验方法

2.1 动物分组 48 只SD 大鼠采用随机数字表法随机分为正常对照组、模型组、穴位注射组、注射结合跑台组，每组12 只，四组大鼠处理之前均进行3 天跑台适应训练（采用段氏PT2000 型鼠类跑台进行运动，坡度0°，速度10m/min，时间10min，连续3 天），以保证实验前大鼠关节基本状况无差异。正常对照组为健康大鼠，不做任何处理；模型组大鼠建立膝关节骨关节炎模型，造模成功后不做任何干预；穴位注射组参照模型组建模后给予鹿瓜多肽注射液穴位注射；注射结合跑台组参照模型组建模后按照穴位注射组方法穴位注射基础上，14 天后进行中等强度跑台训练，持续6 周。

2.2 大鼠膝关节骨关节炎模型建立[4]通过关节腔注射的方式建立膝关节骨关节炎模型大鼠，具体操作如下：采用10%水合氯醛0.3mg/kg，腹腔注射麻醉大鼠。成功麻醉后，在无菌条件下，由髌腱外侧向大鼠右膝关节腔内注射1mL 弗氏完全佐剂，根据超疲劳易提前发生膝骨关节炎的临床发病特点，每天强制大鼠动物活动30～60min，7 天后如出现以下与临床急性膝关节炎表现一致的症状即可确定造模成功：（1）膝关节出现红、肿、热、痛，同时软组织肿胀或积液；（2）膝关节及其周围僵硬、活动受限；（3）膝关节病理切片镜检出现关节腔大量渗出液，软表面粗糙，滑膜增生、粘连、肥厚等膝关节炎临床病理学改变；（4）实验室膝关节积液检查出现白介素1β（1L-1β）升高、透明质酸（HA）含量降低。7 天后，三组大鼠造模均成功，无实验动物感染或死亡发生。所有操作均严格遵循实验动物使用与保护条例规定。

2.3 穴位注射方法 首先将大鼠固定在固定器上，取穴梁丘、血海、委中以及足三里，使用细针头注射器向各穴位注射鹿瓜多肽注射液，1 天1 次，0.1mL/天，连续14 天。具体取穴方式[5]如下：“委中”穴（膝关节背面正中），深度4mm；“足三里”穴（胫骨前结节旁开5mm），深度7mm；“梁丘”穴（髌骨外上缘3mm），深度5mm；“血海”穴（髌骨内上缘3mm），深度5mm。

2.4 跑台训练 中等强度跑台训练方案[6]：上午8∶00～12∶00 进行跑台运动，根据据Bedford 的中等运动强度方案，跑台坡度为0°，初始速度为18m/min，运动时间30min，每天运动1 次，每周运动5 天，共6周。运动中可选用制造声音、小木棒强迫驱动等方式刺激大鼠使其持续运动，但运动过程中不用电刺激。

2.5 观察指标

2.5.1 大鼠膝关节软骨组织学观察 关节软骨取材：以缺损为中心获取股骨远端位置，将其浸润在体积含量为4%的特定溶液中固定24h，随后浸润在10%EDTA 脱钙环境中，保持4 周时间，接着完成包埋切片，蕃红O-固绿染色程序，进行化学检测。观察方法：番红O-固绿染色分析相应软骨的细胞状态，序列特征，同时查看其基质含量、潮线的构成等。借助专业的光镜设备进行观察，O’Driscoll 组织学评分对软骨评分。

2.5.2 免疫组织化学检测膝关节软骨Ⅱ型胶原表达量 软骨标本切片后，进行染色，水洗、封固，镜下观察等流程，最后拍照。采用Image-Proplus 6.0 图像分析软件，测定软骨组织切片单位面积内Ⅱ型胶原纤维免疫组织化学染色吸光度值。

2.5.3 ELISA 法测定实验前后大鼠血清MMP-3 水平 实验前大鼠完成麻醉处理后，在实验大鼠特定位置获取血液1.2mL，常温环境下实施凝固，随后在低温环境中离心处理（2000r/min）15min，获得血清400μL，-80℃存储，血样收集完成后妥善处理伤口。四组大鼠麻醉完成后解剖胸腔，随后在心脏位置抽血1.2mL，慢慢注入相应的采血管中，运用以上相同的方法测定MMP-3 含量。测定方法：借助专业的仪器在450nm 波长下检测吸光度数值。将标准品质量含量作为水平坐标，将A 值作为纵坐标，按照样品A值在对应曲线中的状态，计算实验前后MMP-3 含量。并计算实验前后相应差值。

2.6 统计学方法 应用SPSS 13.0 统计软件对实验数据统计分析。大体观察评分（Mankin’s 评分）采用Kruskal-Wallis H 秩和检验；多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐性，进一步采用Bonferroni 法进行两两比较；若方差不齐，采用Kruska-Wallis H 秩和检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠干预前后软骨切片O’Driscoll 评分比较 干预前模型组、穴位注射组和注射结合跑台组三组大鼠评分差异无统计学意义（P＞0.05），三组评分均低于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；干预6 周后穴位注射组和注射结合跑台组评分均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；注射结合跑台组评分高于穴位注射组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 四组大鼠干预前后软骨O'Driscoll 组织学评分比较（分，）

表1 四组大鼠干预前后软骨O'Driscoll 组织学评分比较（分，）

注：正常对照组为健康大鼠，不做任何处理；模型组为膝骨关节炎模型大鼠；穴位注射组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射结合跑台组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑台训练；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与穴位注射组比较，cP＜0.05

3.2 各组大鼠干预前后膝关节软骨Ⅱ型胶原含量比较 干预前模型组、穴位注射组和注射结合跑台组三组间大鼠软骨Ⅱ型胶原含量差异无统计学意义（P＞0.05），但均低于正常对照组（P＜0.05）；干预后穴位注射组和注射结合跑台组大鼠软骨Ⅱ型胶原含量均高于模型组（P＜0.05）；干预后注射结合跑台组大鼠软骨Ⅱ型胶原含量高于穴位注射组（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原吸光度比较（）

表2 各组大鼠膝关节软骨Ⅱ型胶原吸光度比较（）

注：正常对照组为健康大鼠，不做任何处理；模型组为膝骨关节炎模型大鼠；穴位注射组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射结合跑台组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑台训练；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与穴位注射组比较，cP＜0.05

3.3 各组大鼠干预前后血清MMP-3 含量比较 干预前模型组、穴位注射组和注射结合跑台组三组大鼠血清MMP-3 水平无明显差异（P＞0.05），但均高于正常对照组（P 均＜0.05）；干预后穴位注射组和注射结合跑台组血清MMP-3 水平均低于模型组，差异有统计学意义（P 均＜0.05）；干预后注射结合跑台组血清MMP-3 低于穴位注射组（P＜0.05），见表3。

4 讨论

膝关节骨性关节炎主要病理特点是关节软骨不断丢失，关节内部最为重要的胶原成分属于Ⅱ型胶原，其占据的比例超过了整体胶原的90%[7]。造成关节软骨失去生物力学特征的主要因素即为Ⅱ型胶原和蛋白多糖的改变，包括数量的变化和质量的变化[8-9]。研究表明，MMP-3 是金属蛋白酶组织中的关键组成，在基质降解过程中扮演着重要的角色，对于多糖具备充分的裂解活性[10]，在软骨破坏、特别是骨关节炎的病理发展过程中发挥着关键性的作用[11]。

表3 各组大鼠干预前后血清基质金属蛋白酶-3 含量比较（μg/L，）

表3 各组大鼠干预前后血清基质金属蛋白酶-3 含量比较（μg/L，）

注：正常对照组为健康大鼠，不做任何处理；模型组为膝骨关节炎模型大鼠；穴位注射组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液；注射结合跑台组为膝骨关节炎模型大鼠穴位注射鹿瓜多肽注射液+跑台训练；与正常对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与穴位注射组比较，cP＜0.05

鹿瓜多肽注射液是动植物中提取的多肽类活性成分，它能够降低血黏度和红细胞聚集程度、抑制前列腺素的释放、促进细胞外基质合成，抑制新合成的基质降解；也能对成骨细胞和软骨细胞有促进分化和降低分化的双重调节作用，阻止骨性关节炎的发展。临床观察发现，鹿瓜多肽可以抑制炎性细胞的浸润和控制炎性介质的释放，达到消炎止痛的作用[12]。研究显示，适量运动是维持正常关节组织形态结构及生理功能的必要条件，过度运动或制动均可导致关节软骨退变，中等强度运动对关节软骨有极大好处[13-14]。

本实验结果显示，单一穴位注射组修复的软骨组织从外部观察表现为乳白色，透明度不够，血清基质的量在染色图片中偏低，细胞形态不充分不平衡，排列杂乱，未观察到潮线形成。虽然单一穴位注射治疗的大鼠和穴位注射联合运动治疗的大鼠膝关节软骨MMP-3 表达水平都降低，但是单一穴位治疗组MMP-3 表达明显高于穴位注射联合运动治疗组（P＜0.05），Ⅱ型胶原纤维含量低于穴位注射联合运动治疗组（P＜0.05）。Ⅱ型胶原纤维含量与关节软骨的负重能力相关，说明单一穴位治疗组关节软骨负重能力低于穴位注射联合运动治疗组[15]。虽然注射结合跑台组大鼠的MMP-3 依然高于正常水平，修复的相应软骨组织跟健康软骨组织依然存在差别，但明显比单一穴位注射组更接近正常软骨组织。

综上所述，鹿瓜多肽注射液穴位注射结合中等强度运动可以降低大鼠血清MMP-3 含量，提高大鼠关节软骨Ⅱ型胶原纤维含量，这可能为膝关节炎治疗提供一种临床思路。但本实验有较多不足，比如中等强度运动运动强度如何确定、穴位注射的穴位和剂量如何确定，远期大鼠负重能力的变化情况，穴位注射联合运动降低MMP-3 的可能途径等，这需要后期进一步的研究。