抑制高迁移率组蛋白1 对大鼠急性脊髓损伤后炎性反应的影响

吕建兰 胡劲涛 柴 乐 钱剑胜 任伟凡 全仁夫

急性脊髓损伤（acute spinal cord injury，ASCI）可导致损伤平面以下各种运动、感觉和神经功能障碍，是一种严重的中枢系统损伤，其治疗是世界性临床医学难题[1-2]。本研究应用改良Allen’s 法[3]制备大鼠急性不完全脊髓损伤模型，探讨抑制高迁移率组蛋白（high mobility group box-1 protein，HMGB1）对大鼠ASCI 炎症反应的影响，报道如下。

1 实验材料

1.1 动 物 清洁级雄性Wister 大鼠32 只，体质量（150±20）g，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司[动物使用许可证号：SCXK（沪）2017-0005]，由浙江中医药大学实验动物中心（SPF）分笼饲养，每笼4只，温度20～24℃，湿度50%～70%，适应性饲养1 周后进行实验。

1.2 主要试剂与仪器 HMGB1 抑制剂甘草酸干粉1g/瓶（MB6641，大连美仑生物技术有限公司，大连）、RIPA 裂解液（普利莱基因技术有限公司，北京）、HMGB1 酶联免疫检测试剂盒（E181174）、核转录因子κB（NF-Kbp65）酶联免疫检测试剂盒（E181213）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫检测试剂盒（E189043）、白介素-6（IL-6）酶联免疫检测试剂盒（E190068）、白介素-1β（IL-1β）酶联免疫检测试剂盒（E189705）（均购自Assay 公司，美国）、TaKaRa 试剂盒（RR047A，Invitrogen 公司，美国）、Trizol 试剂（15596026，Invitrogen 公司，美国）；10g 克氏针（江苏金鹿医疗器械公司，ZX105），匀浆器（江苏金伟实验仪器），Bio-Tek ELX800 全自动酶标仪（Thermo Scientific Varioskan Flash），Step one plus PCR 仪（ABl，美国）。

2 实验方法

2.1 脊髓损伤模型建立 应用改良Allen's 法制备急性不完全性脊髓损伤模型大鼠，实验顺序随机进行。大鼠称重后用3%戊巴比妥钠（1.5mL/kg）[4]腹腔注射麻醉，待大鼠无四肢反应后将其俯卧于操作台上，取背部T9-T11 正中切口，钝性分离椎旁肌肉，咬除T10 棘突及全部椎管，暴露0.5cm 宽硬膜，用自制的改良打击装置（质量为10g 的克氏针沿带有刻度的透明管从60mm 高处垂直自由下落，致伤量为60g/cm）造成脊髓中度损伤，使大鼠出现痉挛性摆动、摆尾反射，致伤后迅速移开打击物，逐层缝合切口，大鼠出现双下肢迟缓性瘫痪，运动功能评分（BBB）评分<2 分，证明造模成功[5-6]。术后每天注射青霉素80U 预防感染，连用3 天；每天2 次人工膀胱按摩协助排尿。

2.2 分组及给药 选择健康雄性Wister 大鼠32只，按随机数字表法分为正常组、假手术组、模型组、甘草酸组，每组8 只。假手术组大鼠只咬除T10 棘突和椎板，不损伤脊髓；模型组和甘草酸组大鼠按上述造模法损伤脊髓，模型组大鼠术后正常饲养，不做其它处理，甘草酸组大鼠术后给予甘草酸（溶于生理盐水，200mg/kg）灌胃处理，每天1 次，连用3 天[7]，实验过程无大鼠死亡。术后3 天，腹腔注射3%戊巴比妥钠（1.5mL/kg），待动物麻醉后于冰上迅速剪取以伤段为中心上下各0.5cm 节段脊髓组织存入-80°冰箱，用于ELISA 检测和qRT-PCR 检测。

2.3 检测指标及方法

2.3.1 ELISA 检测大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 及IL-1β 表达量 按照大鼠HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 酶联免疫检测试剂盒使用说明书进行操作，采用生物素双抗夹心技术检测脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。简要实验步骤：准备试剂（生物素标记的抗HMGB1抗体、抗NF-κB 抗体、抗TNF-α 抗体、抗IL-6 抗体、抗IL-1β 抗体、链霉亲和素-HRP），将标准品梯度稀释；加入准备好的样品、标准品、生物素标记二抗和酶标试剂，37℃反应1h；洗板5 次，加入显色液A、B，37℃避光显色10min；加入终止液终止反应；10min内读取各孔的吸光度（OD 值）。根据标准液的检测结果得出标准曲线，求出各组样品的实际浓度。

2.3.2 qRT-PCR 法检测大鼠脊髓组织HMGB1、NFκB、TNF-α、IL-6 及IL-1β mRNA 表达量 采用Trizol 法分组提取总RNA，检测RNA 浓度及纯度。按照TaKaRa 试剂盒说明书进行反转录反应，以待检测基因的引物为模板，采用Step one plus PCR 仪进行荧光定量PCR 检测，以β-actin 作为内参进行相对定量分析。大鼠脊髓损伤区HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA 引物序列由上海生工生物技术合成提供。HMGB1：上游5'-ATGGGC-AAAGGAGATCCTA-3'，下游5'-ATTCTCATCATCT-CTTCT-3'；NFκB：上游5'-CGATCTGTTTCCCCTC-ATCT-3'，下游5'-ATTGGGTGCGTCTTAGTGGT-3'；TNF-α：上游5'-CCAACAAGGAGGAGAAGTTCC-3'，下游5'-CTCTGCTTGGTGGTTTGCTAC-3'；IL-6：上游5'-CTACGAAGAACTGGCAATATG-3'，下游5'-AAACCATCTGGCTAGGTAAGA-3'；IL-1β：上游5'-GACTTCACCATGGAACCCGT-3'，下游5'-GGAGACTGCCCATTCTCGAC-3'；β-actin：上游5'-GCCATGTACGTAGCCATCCA-3'，下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

2.4 统计学方法 应用SPSS 20.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（）表示，正态资料采用单因素方差分析，两两比较应用LSD 法（方差齐）或Tunnett T3 法（方差不齐），非正态资料采用秩和检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β 表达量比较 ELISA 结果显示，脊髓损伤大鼠的HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 水平较未脊髓损伤大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓损伤后，甘草酸灌胃处理大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6、IL-1β 水平较模型组低（P 均＜0.01）。见表1。

3.2 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表达量比较 qRT-PCR 结果显示，脊髓损伤大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNFα、IL-6 和IL-1β mRNA 表达水平较未脊髓损伤大鼠高（P 均＜0.01）；脊髓损伤后，甘草酸灌胃处理大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6 和IL-1β mRNA 表达水平较模型组低（P 均＜0.05）。见表2。

4 讨论

ASCI 的病理过程包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是由强大外力导致的初次损伤，包括压迫和挫裂伤。继发性损伤是在原发性损伤的基础上，机体随后出现的一系列病理、生化反应，主要包括炎性反应、细胞凋亡等。脊髓原发性损伤后随之而来的继发性损伤是导致残余神经通路受损和功能丧失的重要原因，炎性反应是继发性脊髓损伤微环境改变的主要成分，在ASCI 的病理生理学机制中处于中心地位，但对于是何种分子启动了ASCI 后的炎性反应仍有待研究[8-9]。

表1 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB 及相关炎性因子水平比较（pg/mL，）

表1 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB 及相关炎性因子水平比较（pg/mL，）

注：正常组和假手术组无脊髓损伤；模型组和甘草酸组有脊髓损伤，甘草酸组在脊髓损伤后予甘草酸灌胃处理，模型组无特殊处理；HMGB1 为抑制高迁移率组蛋白；NF-κB 为核转录因子κB；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白介素-6；IL-1β 为白介素-1β；与正常组、假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

表2 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB 及相关炎性因子mRNA 表达量比较（×10-3，）

表2 各组大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB 及相关炎性因子mRNA 表达量比较（×10-3，）

注：正常组和假手术组无脊髓损伤；模型组和甘草酸组有脊髓损伤，甘草酸组在脊髓损伤后予甘草酸灌胃处理，模型组无特殊处理；HMGB1 为抑制高迁移率组蛋白；NF-κB 为核转录因子κB；TNF-α 为肿瘤坏死因子-α；IL-6 为白介素-6；IL-1β 为白介素-1β；与正常组、假手术组比较，aP＜0.01；与模型组比较，bP＜0.01

HMGB1 作为一类高度保守的DNA 结合蛋白，稳定存在于正常组织细胞核内，当受到损伤、炎症等理化因素刺激后，组织细胞缺血缺氧，大量的HMGB1可被动/主动的释放至细胞外，与神经元细胞、星形胶质细胞的表面受体结合，即可启动信号转导通路，激活核转录因子NF-κB，通过诱导TNF-α 及IL-6，在炎症的级联反应中发挥重要调节作用[10-11]。

NF-κB 几乎存在于脊髓组织所有的细胞中，其最主要的功能是调控炎性相关基因的转录。脊髓损伤致细胞受刺激后，通过NF-κB 信号通路的活化引起ASCI 后炎性反应以及继发性神经损害，TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎性因子都受NF-κB 的调控[12-14]。ASCI 后的局部缺血、低氧等应激因素导致IKB 的磷酸化，引起NF-κB 活化，激活NF-κB 信号通路，通过上调编码炎症相关因子基因的表达，诱导基因转录，增加炎性介质的合成和释放，而这些炎性介质又反过来激活NF-κB 信号通路，形成的细胞外正反馈调节，可放大炎症效应，加重ASCI 后神经损伤[15]。HMGB1 依赖性的NF-κB 信号通路可能参与脊髓损伤后的炎性反应。HMGB1 作为危险信号分子及炎症介质，可以介导一系列重要的生物学功能，包括触发炎症、以及促进细胞的生长、发育、增殖、凋亡等过程[16-17]。现研究表明，甘草酸可抑制细胞内HMGB1的释放和细胞外HMGB1 活性，对神经起重要保护作用，Kim 等[18]研究发现，甘草酸可通过抑制HMGB1分泌而发挥抗炎作用，对脑神经具有保护作用。Gu等[19-20]也发现甘草酸的抗炎作用可减轻大鼠缺血性脊髓损伤和脑缺血再灌注损伤。

炎性反应是造成ASCI 后不可逆损害的重要病理基础之一。HMGB1 及其受体在中枢神经系统广泛表达，在脊髓损伤后继发的炎症、凋亡及神经功能恢复中起着重要作用，HMGB1 是改善脊髓损伤后神经功能的新颖治疗靶点[21]。本实验前期预实验结果提示，ASCI 后3 天，受损脊髓组织HMGB1 表达出现峰值，参考相关文献[7]，给甘草酸组大鼠行甘草酸灌胃处理，通过ELISA 和RT-qPCR 检测结果显示，模型组和甘草酸组大鼠，由于脊髓遭受急性损伤，脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白及其mRNA 表达量较正常组和假手术组明显增加；但是，在脊髓损伤后使用甘草酸，大鼠脊髓组织HMGB1、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β 蛋白水平及其mRNA 表达量较未使用甘草酸的模型组降低。我们推测HMGB1 至少部分参与介导ASCI 的炎性反应,并与HMGB1 依赖的NF-κB 信号通路密切相关。