滋阴清热药和强的松对狼疮小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA抗体的影响

张保平，程喜平，李楠，凡慧，梁康礼，胡小倩，张穗盈，邓育琼，吴元胜

(1.广州中医药大学金沙洲医院 中医科，广东 广州 510168；2.广州医科大学附属第一医院 皮肤科，广东 广州 510120；3.广东省中医院 皮肤科，广东 广州 510120)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)病因不清，中西医结合治疗SLE具有鲜明特色，滋阴清热药是国医大师禤国维教授根据长期的临床经验总结治疗SLE的方剂，临床疗效确切[1]。研究显示，众多中药具有良好的抗氧化的作用[2]。SLE的氧化应激反应增强，活性氧异常升高，值得关注的是，作为治疗SLE的常用药物，糖皮质激素能增强氧化应激反应，增加活性氧的生成[3]。中药可以抑制活性氧产生，减少对机体的损害[4]。滋阴清热药是治疗SLE有效的方剂，深入研究滋阴清热药抗氧化作用及其生物学意义，对于探索滋阴清热方剂的临床应用具有积极意义。为此，本研究观察滋阴清热药和强的松对MRL/lpr狼疮小鼠血清2，2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2,2-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS]、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及抗ds-DNA抗体(anti-double stranded DNA antibody，anti-ds-DNA antibody)的影响，具体如下。

1 材料与方法

1.1 动物分组24只雌性MRL/lpr狼疮小鼠模型鼠，12周龄，体质量25.1～30.4 g，中位体质量27.6 g。将其随机分为4组：滋阴清热药组、强的松组、滋阴清热药和强的松合用组(合用组)、空白对照组。动物均购自南京大学动物模型实验中心，实验动物质量合格证编号：44007200001471。

1.2 实验用药滋阴清热方组：山萸肉15 g、生地黄20 g、茯苓15 g、泽泻15 g、牡丹皮15 g、青蒿8 g、甘草6 g(由广州医科大学附属第一医院中药房提供)，水煎后，浓缩处理(中药含药量为94 g)，生药浓度为1.5 g·L-1，按照0.02 mL·g-1剂量灌胃，每日1次。强的松组：配制0.3 g·L-1的强的松(上海医药有限公司，国药准字H31020675)药液，按照0.02 mL·g-1剂量灌胃，每日1次。合用组：同时接受滋阴清热药和强的松药液灌胃，方法和剂量同前。空白对照组：接受0.6 mL生理盐水灌胃，每日1次。均干预治疗3个月。

1.3 方法和试剂治疗3个月后脱颈处死小鼠，心脏取血，血液在37 ℃条件下静置30 min，3 000 r·min-1离心10 min后取血清进行ABTS、MDA和抗ds-DNA抗体检测。

1.3.1ABTS检测 采用快速ABTS法(碧云天，上海，中国)检测标本的总抗氧化能力，并用mmol·g-1蛋白表示。(1)配制ABTS母液：ABTS溶液100 μL，氧化剂溶液100 μL，室温避光存放12 h。(2)配制ABTS工作液：在使用前用PBS稀释母液，ABTS母液200 μL，PBS 7 800 μL。(3)待测样品的准备：血液在37 ℃条件下静置30 min，3 000 r·min-1离心10 min后取血清，血清可直接用于测定。(4)稀释标准溶液：使用PBS把10 mmol·L-1Trolox标准溶液稀释成0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol·L-1。(5)总抗氧化能力的测定：①96孔板的每个检测孔中加入200 μL ABTS工作液；②空白对照孔中加入10 μL PBS溶液，标准曲线检测孔内加入10 μL各种浓度的Trolox标准溶液，样品检测孔内加入10 μL血清样品，轻轻混匀；③室温孵育2～6 min后，采用Multiskan Sky全波长酶标仪，Thermo Fisher测定734 nm的吸光度值。

1.3.2MDA检测 采用脂质过氧化法和硫代巴比妥酸法测定血清MDA水平(碧云天，上海)，单位：μmol·g-1。(1)配制TBA储存液：采用TBA配制液加热到70 ℃以促进溶解，配制成质量浓度为3.7 g·L-1的TBA储存液。(2)配制MDA检测工作液：TBA稀释液1 500 μL，TBA储存液500 μL，抗氧化剂30 μL。(3)稀释标准品：取适量标准品用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50 μmol·L-1，用于制作标准曲线。(4)样品测定：①每管加入0.1 mL PBS等适当溶液作为空白对照，加入0.1 mL不同浓度标准品用于制作标准曲线，加入0.1 mL血清，随后加入0.2 mL MDA检测工作液；②混匀后，100 ℃水浴加热15 min；③水浴冷却至室温，1 000 g室温离心10 min，取200 μL上清加入到96孔板中，随后用酶标仪在532 nm测定吸光度。④计算MDA：根据标准曲线计算获得MDA的摩尔浓度。

1.3.3血清抗dsDNA抗体检测 采用酶联免疫吸附试验测定血清抗ds-DNA抗体，按试剂盒说明进行相关操作。在分光检侧仪上读取450 nm波长的OD值。

2 结果

滋阴清热药组ABTS水平高于其他3组，差异有统计学意义(均P<0.05)；强的松组ABTS水平低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。强的松组MDA水平高于其他3组，差异有统计学意义(均P<0.05)。滋阴清热药组、强的松组、合用组抗ds-DNA抗体水平均低于空白对照组，差异有统计学意义(均P<0.05)；滋阴清热药组、强的松组、合用组抗ds-DNA抗体水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 滋阴清热药对MRL/lpr狼疮小鼠血清ABTS、MDA及抗ds-DNA的影响

注：ABTS—2,2-联氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)；MDA—丙二醛。

3 讨论

正常生理状态下，机体氧化还原反应可以产生低剂量的ROS，对维持机体细胞稳态和功能有重要意义。病理状态下，氧化应激反应产生超量ROS对机体十分有害，不仅可以引起氧化，形成氧化终产物，如丙二醛，导致蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合，从而丧失功能，也能引起细胞DNA受损，诱发细胞凋亡，还能通过多种途径诱发免疫炎症，引起组织器官损害[5]。SLE是一种多器官受累的自身免疫性疾病。研究显示，SLE氧化应激反应过度，生成超量活性氧，引起免疫炎症因子异常升高，应用活性氧拮抗剂干预氧化应激，抑制或减少超量活性氧的形成，可以降低炎症因子水平和血清抗ds-DNA抗体浓度[6]，从而缓解病情。很多植物类食物具有良好的抗氧化作用，可以减少哺乳动物活性氧的超量产生。中药同样具有良好的抗氧化作用，可以减少活性氧超量生成，减轻免疫炎症。理论上，中药抗氧化作用有益于SLE病情缓解。滋阴清热药是国医大师禤国维教授临床治疗红斑狼疮的有效方剂，中药复方成分复杂，作用靶点多，研究和阐明中药有效方剂的机制一直是努力的方向。

ABTS法是一种常用的抗氧化检测方法，抗氧化剂清除能力以ABTS吸光度大小与标准抗氧化剂比值做指标，比值越高，抗氧化能力越强[7]。本研究结果显示，滋阴清热药组ABTS水平高于强的松组、合用组和空白对照组，说明滋阴清热药具有良好的抗氧化作用，提示滋阴清热药可以通过抗氧化途径缓解SLE的病情。本研究结果还显示，强的松组的抗氧化作用低于空白对照组，强的松加重氧化应激反应，理论上可以诱导免疫炎症加重。因此，单独从氧化应激反应角度评价强的松对SLE作用，不利于病情缓解。强的松是临床上SLE主要用药，在控制免疫炎症进行性加重，稳定病情方面具有一定疗效，但强的松也有一系列不良反应，目前未查阅到糖皮质激素加重SLE氧化应激反应后对其病情活动进一步影响的报道。机体的免疫系统是一个复杂网络系统，深入研究强的松加重氧化应激反应的意义，对于减轻糖皮质激素的副作用，改善SLE治疗现状具有积极意义。

滋阴清热药和强的松在抗氧化应激过程中的作用不同。强的松是公认治疗SLE有效药物，滋阴清热药同样是治疗SLE的有效药物。为进一步明确滋阴清热药和强的松抗氧化应激反应的不同作用可能产生的临床意义，本研究对各组进行了血清氧化终端产物MDA和抗ds-DNA抗体检测。结果显示，强的松组MDA水平高于其他3组，机体内存在大量的不饱和脂肪酸，极易受到过氧化作用的损伤。MDA是脂质过氧化反应链式的终端小分子产物之一，是目前公认能反映活性氧超量产生并引发脂质过氧化反应的指标。MDA不仅是生物体氧化应激的标志物，还具有很强的毒副作用，其作用机制是极易与生物分子中的氨发生非特异性反应，导致分子内或分子间发生交联反应，引发严重的细胞毒性、遗传毒性、神经毒性、致突变或致癌变作用等[8]。糖皮质激素的副作用是否和MDA有关需进一步研究。本研究结果还显示，滋阴清热药组在抗氧化方面有良好的生物效果，MDA水平低于强的松组，两者不同作用特点的临床意义值得深入研究。本研究结果显示，滋阴清热药组、强的松组、合用组的血清抗ds-DNA抗体水平均低于空白对照组，合用组、滋阴清热药组、强的松组抗ds-DNA抗体水平无明显差异。以往研究显示，SLE患者氧化应激反应增强，在活性氧激化下，抗ds-DNA抗体水平可异常升高，并加重SLE损害[9]。Maeshima等[10]发现维生素E通过减轻活性氧对DNA结构，特别是线粒体结构的损害，减少抗ds-DNA抗体生成。N-乙酰半胱氨酸是外源性活性氧拮抗剂，口服NAC可显著降低MRL/lpr狼疮小鼠血清自身抗体水平，改善狼疮性肾炎[11]。本研究结果提示：尽管滋阴清热药和强的松抗氧化作用截然不同，滋阴清热药具有抗氧化作用，而强的松则能加重氧化作用，但两者降低抗ds-DNA抗体水平却一致，提示滋阴清热药治疗SLE作用机制可能不同于糖皮质激素，滋阴清热药和强的松对SLE具有良好的协同作用。合用组抗ds-DNA抗体水平低于滋阴清热药组和强的松组，推测滋阴清热药和强的松可能存在共同的作用机制，能有效平衡两者抗氧化差异，显示中西医结合协同作用仍是主要方面。

综上，强的松是治疗SLE主要临床用药，控制SLE病情的同时也有明显的副作用。滋阴清热药组在抗氧化方面作用优于强的松，在抗氧化终端产物MDA的产生中也优于强的松，提示滋阴清热药治疗SLE具有优势和特色。因此，循着抗氧化的途径，深入研究滋阴清热药新的作用途径，探索滋阴清热药的有效成分，可能取得疗效更佳、副作用更小的治疗SLE的有效成分，有益于推动研制具有中医特色且疗效较好的SLE新药。