四种含抑菌成分外用制剂微生物限度检查方法验证

倪玉佳，汤 露，戈 煜，董文燊，瞿发林

0 引 言

醋酸氯己定洗剂、复方樟脑搽剂、含酚炉甘石涂剂及复方硝酸咪康唑软膏均为我院自制外用制剂，分别已取得制剂批准文号［南制字（2016）B513004、南制字（2016）B513007、南制字（2016）B513006、总制字（2019）F513008］，临床疗效显著。国家药典委员会颁布的2015年版《中国药典》，对药品提出了更高的检验要求［1-2］，医院制剂在微生物验证方面存在巨大的挑战。众所周知，外用制剂常含乙醇、苯酚、樟脑、抗生素等抑菌成分，同时为了防止制剂因微生物污染引起腐败变质，常常加入防腐剂延长制剂有效期，而这些物质常有较强的抑菌作用，会对微生物限度检查方法的建立带来极大的困难。含抑菌成分的外用制剂若采用平皿法，试验菌回收率难以达到要求，故参照文献［3-5］中的方法，采用薄膜过滤法进行方法适用性试验，为我院四种外用制剂建立了方便可靠、快速便捷的微生物限度检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器电子天平（设备型号：EL-300J，常州天之平仪器设备公司）；洁净工作台（设备型号：SM-CJ-1FD，苏州安泰空气技术有限公司）；隔水式恒温培养箱（设备型号：303-3B，南通科学仪器厂）；霉菌培养箱（设备型号：SPX-150B，上海浦东荣丰仪器公司）；电热恒温水浴锅（设备型号：HHS，上海医疗器械五厂）；立式压力蒸汽灭菌锅（设备型号：LDZX-30KBS，上海申安医疗器械厂）。

1.1.2 制剂A：醋酸氯己定洗剂（规格：200 mL；批号：20170411、20170615、20170714）；B：复方樟脑搽剂（规 格：100 mL；批 号：20170322、20170922、20180228）；C：含酚炉甘石涂剂（规格：100 mL；批号：20170329、20170922、20180322）；D：复方硝酸咪康唑软膏（原菌克软膏）（规格：20 g；批号：20180118、2018323、20180426）。上述制剂为本院自制。

1.1.3 菌株金黄色葡萄球菌［编号CMCC（B）26003，批号26003-5a28-5］、枯草芽孢杆菌［编号CMCC（B）63501，批号63501-2a22-1］、铜绿假单胞菌［编号CMCC（B）10104，批号10104-2a20-3］、白色念珠菌［编号CMCC（B）98001，批号98001-2a15-3］及黑曲霉菌［编号CMCC（F）98003，批号0A1001］为0 代冻干粉，均购于中国食品药品检定研究院，活化后使用。

1.1.4 培养基及稀释剂培养基分别为：胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号分别 为160802、1609262、161113、161017、160309、160226）。稀释剂：pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：160801）。均由北京三药科技开发公司生产。

1.1.5 试剂十四烷酸异丙酯（批号：20170807）、聚山梨酯80（批号：20170925），由国药集团化学试剂有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌液依照2015年版《中国药典》所要求的制备方法，分别制成试验所需的菌悬液浓度［6］。

1.2.2 供试液A（醋酸氯己定洗剂）：供试品原液。B（复方樟脑搽剂）及C（含酚炉甘石涂剂）：各取10 mL 供试品，加pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液适量，使得共100 mL，混合均匀，制成1∶10 的供试液。D（复方硝酸咪康唑软膏）：取50 g软膏加入50 mL无菌十四烷酸异丙酯，研磨5 min 后加入少许无菌含10%聚山梨酯80［7］的pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，继续研磨5 min后加入500 mL已预热的（44℃）无菌含10%聚山梨酯80 的pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液，水浴保温（44℃）静置40 min，得到1∶10的溶液，取水层作为供试液。

1.2.3 微生物计数检查方法的验证①试验组：A制剂，取供试液原液100 mL，加入相应试验菌1 mL（菌终浓度不大于100 cfu/mL），混匀。B、C 制剂，各取“1.2.2”项下供试液100 mL，加入相应试验菌1 mL（菌终浓度不大于100 cfu/mL），混匀。以上混匀液体，各取1 mL（每膜），薄膜过滤，用pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗次数分别为10 次、5次、4 次，每次冲洗量为100 mL。转移试验滤膜且菌面朝上，贴于对应的琼脂培养基平板，培养计数。D 制剂，取已制得的1∶10 供试液50 mL，分别加入各试验菌0.5 mL（菌液终浓度不大于100 cfu/mL），混匀后1 mL 过膜，取500 mL pH 7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液（含1%聚山梨酯80）分5 次冲洗，冲洗结束后贴于对应琼脂培养基进行培养。②供试品对照组：取制备好的供试液，用稀释液替代所加菌液，操作方法同试验组。③菌液对照组：用稀释液替代所加供试液，具体操作同试验组。④回收率计算：计算各对应试验菌的回收率比值。回收率R 需在0.5～2 之间，否则表明验证方法不适宜。回收率R计算公式：

1.2.4 控制菌检查验证因四种制剂为外用制剂，故而控制菌试验涉及到铜绿假单胞菌与金黄色葡萄球菌的方法验证。①试验组：A 制剂两种控制菌皆采用薄膜过滤法，取供试液1 mL 每膜，1000 mL pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，每次100 mL，冲洗10 次；B、C 制剂采用薄膜过滤法，取1∶10 供试液10 mL 每膜，300 mL pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，每次100 mL，冲洗3 次；D 制剂，铜绿假单胞菌采用常规法，金黄色葡萄球菌采用薄膜过滤法，取1∶10 供试液10 mL 每膜，500 mL 含1%聚山梨酯80的pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，每次100 mL，冲洗5 次。以上试验组均加入不大于100cfu 的试验菌，且D 制剂金黄色葡萄球菌检查试验于200 mL 的胰酪大豆胨液体培养基中进行培养，其余控制菌的检查均于100 mL 的胰酪大豆胨液体培养基中进行培养。②供试品对照组：除不加入相应控制菌，其余操作与试验组相同。③菌液对照组：除不加入供试液，其余操作与试验组相同。④阴性组：除不加入相应控制菌及供试液，其余操作与试验组相同。

2 结 果

2.1 微生物计数检验方法验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均在0.5～2.0，满足验证要求，见表1、表2。

2.2 控制菌检查方法验证各制剂3 批样品控制菌检查验证结果显示，试验组均可检出铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌，且菌液对照组阳性菌正常生长，供试品对照组及阴性组均未检出该两种控制菌，验证结果满足中国药典要求。

表1 四种含抑菌成分外用制剂需氧菌总数的验证回收率

表2 四种含抑菌成分外用制剂霉菌和酵母菌总数的验证回收率

3 讨 论

关于非无菌药品的微生物限度检查，2015年版的《中国药典》［6］相较于2010年版的《中国药典》［8］，无论在微生物计数部分还是控制菌检查方面都进行了培养基、培养温度、检查方法等方面的调整，故而在进行含抑菌成分制剂的微生物限度适用性方法的试验时，两版药典的验证结果也不一致。按2010年版的《中国药典》所规定的验证方法仅需采用培养基稀释法即可解决制剂抑菌性强的问题，但当按2015年版的《中国药典》验证方法时，往往试验菌回收率达不到要求，需更换验证方法（如薄膜过滤法）或寻求更合适的供试品处理方法（如加入中和剂、灭活剂，增加稀释液、培养基体积）才能满足试验要求［6］。虽然部分制剂采用2015年版的《中国药典》所规定的验证方法在操作性上存在一定的困难，但该版本所规定的培养基能满足大多数需氧菌的生长，有效提高污染菌的检出率［9-10］，试验最后得出的验证方法不仅灵敏，而且更能保证广大群众的药品安全。

本文所述的四种常用外用制剂多用于皮肤、黏膜消毒，皮肤瘙痒症，皮炎等。此类制剂通常含有较强的抑菌成分，如醋酸氯己定洗剂，所含的醋酸氯己定为阳离子表面活性剂，有极强的广谱抗菌、杀菌作用［11］；复方樟脑搽剂含樟脑、苯酚、薄荷脑、乙醇［11-13］；含酚炉甘石涂剂含苯酚［11］、炉甘石；复方硝酸咪康唑软膏含盐酸林可霉素（抗生素类药）、硝酸咪康唑（广谱抗真菌类药）和醋酸地塞米松。故要求被试验供试品在有效去除自身抑菌作用下才能进行污染菌限度的检验，否则不能确保该制剂所污染的微生物被有效地检出。

与此同时，醋酸氯己定洗剂及复方樟脑搽剂为均相溶液剂，能顺利通过滤膜；含酚炉甘石涂剂为混悬剂，振摇后为均匀的粉红色混悬液，且所含的氧化锌及炉甘石不溶于水，采用薄膜过滤法时会出现堵膜的情况；而复方硝酸咪康唑软膏为软膏剂，其基质尤为复杂，更加需要合适的处理方法才能解决过膜困难的问题，故而针对不同类型的制剂需根据各自特点采用不同验证方案。由于目前现行版《中国药典》删除了离心法［6］，故本试验将供试品含酚炉甘石涂剂静置后取上清液进行试验，回收率良好。另一制剂复方硝酸咪康唑软膏，因其复杂基质及抗菌性［14］，本试验采用含10%聚山梨酯80 的pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液处理供试品后，静置取水层液进行试验［15］，结果亦满足要求。

经过试验，建立了适合于洗剂、搽剂、涂剂、软膏剂四种不同类型外用制剂的微生物限度检查方法，试验所规定的验证菌回收率比值均在0.5～2 之间，控制菌试验满足实验要求，为部分外用制剂在进行微生物限度验证试验前提供了参考方法，同时为医院制剂的质量控制提供了可靠的检测手段。